酸枣SSR分子标记开发方法及在酸枣种质资源鉴定中的应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及了基于酸枣转录组测序的酸枣SSR分子标记开发方法，以及利用开发的SSR分子标记在酸枣种质资源鉴定中的应用。本发明专利技术开发的SSR分子标记具有稳定性好、有效性高的特点。本发明专利技术以酸枣为材料，通过转录组测序、SSR位点分析鉴定、SSR引物设计、SSR

【技术实现步骤摘要】
酸枣SSR分子标记开发方法及在酸枣种质资源鉴定中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及了酸枣SSR分子标记开发方法及在酸枣种质资源鉴定中的应用。

技术介绍

[0002]酸枣(Ziziphusjujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chow)为鼠李科枣属植物，通常为灌木或小乔木，喜温耐干旱，适应性强，广泛分布在我国广大的北方地区。酸枣在我国已有4000多年种植历史，是我国传统的中药资源。酸枣是2012年我国颁布的第一批药食同源药用植物之一，其根、皮、叶、果肉和仁都含有大量的生物活性物质，具有很高的药品、保健品开发潜力。其中，酸枣果肉可以加工成酸枣汁、酸枣醋、酸枣面等；酸枣核是优质活性炭原料，可做工艺品；酸枣叶可以作为茶原料开发，具有养神、利尿、消炎等保健功效；酸枣仁含有丰富的生物活性次生代谢物，包括酸枣仁皂苷A、B、斯皮诺素、酸枣仁油、生物碱等多种药用成分。
[0003]随着市场对酸枣需求量的增加，不少酸枣主产区开始异地引种栽培工作，导致酸枣遗传背景不清、种质资源混杂、多品种间形态相似，影响着酸枣优质资源选育，使酸枣产业开发面临挑战。SSR(Simple Sequence Repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术。与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)操作简单，对DNA要求不高，重复性好。目前还没有酸枣SSR分子标记开发相关的报道，因此，基于酸枣转录组信息分析，设计SSR序列引物，开发具有潜在多态性的SSR分子标记，对酸枣种质资源遗传背景分析，开展品种真伪鉴别，分子辅助酸枣的育种工作显得尤为重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术在酸枣转录组测序的基础上，获得大量的SSR信息，通过PCR扩增、聚丙烯酰氨凝胶电泳检测对选取的SSR引物进行验证和多态性分析，从而获得有效性的SSR分子标记引物组合在酸枣种质资源鉴定中的应用，为后续利用SSR分子标记开展酸枣的种质资源鉴定、亲缘关系和遗传多样性分析、真伪品鉴别和分子辅助酸枣的新品种选育提供可靠的技术手段。
[0005]本专利技术提供基于酸枣转录组开发的SSR分子标记引物组合在酸枣种质资源鉴定中的应用，引物分别为SSR44、SSR48、SSR86、SSR97，上述引物对应的上下游核苷酸序列如下：
[0006](1)SSR44引物：
[0007]SEQ ID NO.1:SSR44
‑
F:5`
‑
CTCATCGGCGAGATCTTCCC
‑
3`
[0008]SEQ ID NO.2:SSR44
‑
R:5`
‑
TACCGAAAAACTCGCCGGAA
‑
3`
[0009](2)SSR48引物：
[0010]SEQ ID NO.3:SSR48
‑
F:5`
‑
AGGGAGAGATGGGAGCATGT
‑
3`
[0011]SEQ ID NO.4:SSR48
‑
R:5`
‑
TGCACGACCCCACATTCTAC
‑
3`
[0012](3)SSR86引物：
[0013]SEQ ID NO.5:SSR86
‑
F:5`
‑
GCATGGCGTGTTGGATTTGT
‑
3`
[0014]SEQ ID NO.6:SSR86
‑
R:5`
‑
ATCCAACTTAGCTGCCCACC
‑
3`
[0015](4)SSR97引物：
[0016]SEQ ID NO.7:SSR97
‑
F:5`
‑
GCCGATGATAAAACCGCCAC
‑
3`
[0017]SEQ ID NO.8:SSR97
‑
R:5`
‑
TTGGTGAAGACGCTGAGGAC
‑
3`
[0018]本专利技术提供了上述引物组合在酸枣种质资源鉴定、亲缘关系和遗传多样性分析中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0019](1)通过转录组测序技术对酸枣样本进行转录组测序，将测序数据进行过滤，去除其中的接头序列及低质量的数据，进行序列组装获得高质量的酸枣转录组数据
[0020](2)从转录组数据进行SSR检测
[0021](3)根据SSR信息进行引物设计
[0022](4)酸枣DNA提取
[0023](5)PCR体系扩增对引物进行筛选
[0024](6)聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染进行引物有效性鉴定
[0025]上述步骤(1)转录组测序样本为河北邢台道地药材酸枣的叶片。
[0026]上述步骤(2)转录组SSR检测是采用MISA软件对转录组中的gene进行SSR进行鉴定，鉴定出6种类型的SSR：单碱基(Mono
‑
nucleotide)重复SSR、双碱基(Di
‑
nucleotide)重复SSR、三碱基(Tri
‑
nucleotide)重复SSR、四碱基(Tetra
‑
nucleotide)重复SSR、五碱基(Penta
‑
nucleotide)重复SSR和六碱基(Hexa
‑
nucleotide)重复SSR。
[0027]上述步骤(3)SSR引物设计方法：利用Primer 3.0(2.5.0版本)软件在SSR两端互补序列来设计引物，引物长度为20
‑
25bp，引物扩增长度为150bp
‑
350bp，GC含量在40％
‑
60％之间，退火温度为50
‑
55℃，上下游引物Tm值相差不大于2℃，避免引物二聚体、错配和发卡结构的出现。
[0028]上述步骤(4)酸枣DNA提取采用CTAB法，提取后用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，NanoDrop ND2000分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，DE)检测DNA浓度和纯度。所有样品DNA的A260/A280检测值在1.79
‑
1.95之间。将全部DNA的浓度统一稀释100ng
·
μL
‑1，
‑
20℃冰箱保存备用。
[0029]上述步骤(5)PCR扩增体系为20μL：dNTP 0.8μL、Tag酶0.2μL、10
×
buffer2μL、ddH2O 15.6μL、正反向引物各0.2μL，DNA 1μL；PCR反应程序为：94℃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鉴定酸枣种质资源的SSR分子标记引物组合，其特征在于，所述引物组合由4对引物组成，包括SSR44、SSR48、SSR86、SSR97，上述引物对应的上下游核苷酸序列如下：（1）SSR44引物：SEQ ID NO.1: SSR44
‑
F: 5`
‑ꢀ
CTCATCGGCGAGATCTTCCC
‑
3`SEQ ID NO.2: SSR44
‑
R: 5`
‑ꢀ
TACCGAAAAACTCGCCGGAA
‑
3`（2）SSR48引物：SEQ ID NO.3: SSR48
‑
F: 5`
‑ꢀ
AGGGAGAGATGGGAGCATGT
‑
3`SEQ ID NO.4: SSR48
‑
R: 5`
‑ꢀ
TGCACGACCCCACATTCTAC
‑
3`（3）SSR86引物：SEQ ID NO.5: SSR86
‑
F: 5`
‑ꢀ
GCATGGCGTGTTGGATTTGT
‑
3`SEQ ID NO.6: SSR86
‑
R: 5`
‑ꢀ
ATCCAACTTAGCTGCCCACC
‑
3`（4）SSR97引物：SEQ ID NO.7: SSR97
...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜涛，田伟，欧阳艳飞，刘灵娣，马致静，温春秀，齐琳琳，
申请(专利权)人：河北省中医药发展中心，
类型：发明
国别省市：