一种食源性致病菌快速光色多信号检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒及方法，它包括：食源性致病菌适配体溶液，胶体金溶液，异硫氰酸荧光素溶液，阴性质控品，阳性质控品。它通过简单的离心实现了食源性致病菌的特异性识别，利用食源性致病菌适配体诱导胶体金冻融后发生聚集变化，根据胶体的聚集颜色变化和异硫氰酸荧光素影响，对金黄色葡萄球菌进行定量检测，定量检测时变异系数小，方法灵敏度高，线性范围广，成本较低，操作简单，易于实施，检测时间短，比色信号检测限为5 CFU/mL，荧光定量检测限为2 CFU/mL，双信号不仅实现了现场可视化，还提高了检测准确度。测准确度。

【技术实现步骤摘要】
一种食源性致病菌快速光色多信号检测试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物传感
，具体涉及一种食源性致病菌快速光色多信号检测试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]细菌污染严重影响人体健康，是公共卫生领域关注的重要问题。细菌广泛存在于自然界，如水、空气、尘埃、人和动物的排泄物中，其可通过飞沫，接触，饮用水和食物等途径进入人体，感染发病率较高，对人体健康产生较大的威胁。其中，食源性致病菌作为食品中生物性污染物对人类健康构成了重大威胁。据世界卫生组织估计，每年全世界约有6亿人因食物污染而导致中毒或者患病，42万人死于食物中毒，其中三分之一是五岁以下儿童。我国国家标准《食品中致病菌限量》中规定的食品必检的食源性病原菌包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌 O157:H7。这些标准和规范为保障食品安全和人群健康提供了保障，但是，预防食品污染是全球卫生保健系统和食品行业的一个永恒挑战，能够建立快速、灵敏和准确检测的致病菌检测方法并在此基础上及时作出应对措施具有重要的意义。
[0003]目前针对致病菌的检测方法主要有分离培养法、分子生物学检测方法、免疫学方法等，虽然这些方法能实现对食源性致病菌的检测，但仍存在各自的缺点，例如分离培养法为食源性检测的“金标准”，也是我国国家标准中推荐的方法，但实验周期耗时较长，且操作复杂，不能满足对样品快速检测的需求；其它检测方法，如分子生物学检测方法技术操作复杂、成本高以及需要专业的工作人员；酶联免疫法则需要利用生物酶，生物酶价格昂贵，并且其活性容易受到温度、pH等环境因素的影响。因此，迫切需要开发一种操作简单、易于实施、快速和灵敏度高的现场检测方法。
[0004]食源性致病菌检测的关键问题之一是实现大量样本的现场快速筛检。目视比色分析法是最好的现场快速信号筛检方法。胶体金材料因具有良好的生物相容性、大比表面积、光电特性、表面等离子共振效应。其摩尔吸光系数随着粒径的增加逐渐降低，紫外可见吸收峰蓝移，呈现肉眼可见的颜色变化。因此，胶体金被广泛用于现场目视比色传感检测中。但是，目视比色法信号单一，灵敏度低，无法实现定量检测。多信号分析方法是具有自校正和自验证的新型检测方法（Fu, X., Sun, J., Ye, Y., Zhang, Y., Sun, X. (2022). A rapid and ultrasensitive dual detection platform based on Cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug
‑
resistant Salmonella. Biosensors and Bioelectronics, 195, 113682.）。该检测系统可以通过一次反应产生两个及以上光、电、色信号，信号彼此之间可以校正，互为参考，可以弥补目视比色分析法的不足用于现场实践。异硫氰酸荧光素是一种重要的荧光染料分子，价格低廉，对光的消光系数高、荧光量子产率好，被广泛用于蛋白荧光标记。核酸适配体是利用体外指数富集的配体系统进化技术筛选的寡核苷酸片段能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合靶标，在医学、生物、环境和农林等检测分析领域具有很大的应用前景。
[0005]综上所述，为了实现食源性致病菌的现场筛检，开发一种快速，简单，准确度高，特异性强的检测方法和试剂盒，对食品微生物检验等领域具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种食源性致病菌光色多信号检测方法及试剂盒。
[0007]一种食源性致病菌快速光色多信号检测试剂盒，它包括：致病菌适配体溶液，胶体金溶液，异硫氰酸荧光素溶液；
[0008]所述的食源性致病菌适配体溶液浓度为10
ꢀµ
M
‑
30
ꢀµ
M；所述的胶体金粒径为13
‑
40 nm，表面官能团为羧基；所述的异硫氰酸荧光素溶液浓度为2.5
‑
20 μM；
[0009]所述的食源性致病菌包括：金黄色葡萄球菌、李斯特菌大肠杆菌；
[0010]所述的金黄色葡萄球菌适配体基因序列为5'SH
‑
GCA ATG GTA CGG TAC TTC CTC GGC ACG TTC TCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA AAA GTG CAC GCT ACT TTG CTA A
‑
3'。
[0011]所述的胶体金溶液是采用氯金酸和柠檬酸三钠反应制备的。
[0012]所的反应为将1 mM的氯金酸加热至沸腾，在剧烈搅拌的状态下快速加入4 mmol/L柠檬酸三钠，反应20 min。
[0013]所述的适配体溶液浓度为20 μM；异硫氰酸荧光素FITC的优选浓度为15 μM；所述的胶体金为粒径为13 nm。
[0014]所述的试剂盒还包括阴性质控品磷酸缓冲液，阳性质控品灭活金黄色葡萄球菌悬液。
[0015]一种食源性致病菌快速比色/荧光检测方法，它包括：采用权利要求1所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒；
[0016]1）待检样品加入缓冲液充分混匀后，将浸提液转入离心管中；
[0017]所述的缓冲溶液体积为5
‑
10 mL，优选的体积为5 g样品加缓冲液10 mL；
[0018]2） 加入食源性致病菌适配体溶液，漩涡混匀后在37 ℃下孵育15
‑
90 min，离心分离，用移液器吸出上清；
[0019]3）取上清溶液加入到胶体金溶液中，在温度为
‑
20～
‑
80 o
C冷冻10
‑
60 min，在温度25
‑
70 o
C下融解后，目视观察或用紫外可见光谱仪测定胶体金溶液在400
‑
800 nm处扫描光谱；
[0020]4）将溶解后的胶体金溶液进行离心以去除聚集的纳米粒子，加入荧光素溶液孵育，使用荧光光度计测量荧光，确定食源性致病菌的含量。
[0021]步骤3）所述的冷冻温度为
‑
80 o
C，时间为10 min，融解温度为70 o
C。
[0022]步骤2）所述的孵育时间为60 min。
[0023]本专利技术提供了一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒及方法，它包括：食源性致病菌适配体溶液，胶体金溶液，异硫氰酸荧光素溶液，阴性质控品，阳性质控品。它通过简单的离心实现了食源性致病菌的特异性识别，利用食源性致病菌适配体诱导胶体金冻融后发生聚集变化，根据胶体的聚集颜色变化和异硫氰酸荧光素影响，对金黄色葡萄球菌进行定量检测，定量检测时变异系数小，方法灵敏度高，线性范围广，成本较低，操作简单，易于实施，检测时间短，比色信号检测限本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，它包括：食源性致病菌适配体水溶液，胶体金溶液，异硫氰酸荧光素溶液；所述的金黄色葡萄球菌适配体溶液浓度为10
ꢀµ
M
‑
30
ꢀµ
M；所述的胶体金粒径为13
‑
40 nm，表面官能团为羧基；所述的异硫氰酸荧光素溶液浓度为2.5
‑
20 μM。2.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，其特征在于：所述的食源性致病菌为金黄色葡萄球菌，适配体基因序列为5'SH
‑
GCA ATG GTA CGG TAC TTC CTC GGC ACG TTC TCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA AAA GTG CAC GCT ACT TTG CTA A
‑
3'。3.根据权利要求1、2所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，其特征在于：所述的胶体金溶液是采用氯金酸和柠檬酸三钠反应制备的。4.根据权利要求3所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，其特征在于：所的反应为将1 mM的氯金酸加热至沸腾，在剧烈搅拌的状态下快速加入4 mmol/L柠檬酸三钠，反应20 min。5.根据权利要求3所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，其特征在于：所述的适配体溶液浓度为20 μM；异硫氰酸荧光素FITC的浓度为15 μM；所述的胶体金为粒径为13 nm。6.根据权利要求5所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括阴性质控品：磷酸缓冲液，阳性质控品：灭活金黄色...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐燕飞，孙瑞蒙，张晓宇，杜婷，李雨函，马海楠，孙浩霖，张李娜，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：