一种检测活性污泥系统中活性功能菌的方法技术方案

一种检测活性污泥系统中活性功能菌的方法，属于污水生物处理技术领域。本发明专利技术利用改良的生物正交氨基酸标记染色法联合流式细胞仪分选技术和测序技术对污水处理系统中功能活性微生物的种群占比。通过改良的生物正交氨基酸标记染色法对活性功能菌进行特异性染色，在利用流式细胞仪识别并分选出活性功能细菌种群；分选后的细菌进行预处理后，根据改良的微量DNA试剂盒对样品进行预处理，进而利用苯酚抽提法提取DNA，并对提取后的DNA进行16SrRNA高通量测序；根据分选前和分选后的高通量测序结果进行比对，得出活性功能菌的种群丰度。本发明专利技术提供了一种经济、简便、可靠的污水处理系统活性污泥中活性功能菌的定量方法。处理系统活性污泥中活性功能菌的定量方法。处理系统活性污泥中活性功能菌的定量方法。

【技术实现步骤摘要】
一种检测活性污泥系统中活性功能菌的方法


[0001]本专利技术涉及一种检测活性污泥系统中活性功能菌的方法，属于污水生物处理
，用于对污水生物处理系统中活性功能菌的种群定量分析。

技术介绍

[0002]水体富营养化已经成为我国可持续发展所面临的重要环境问题之一，而氮、磷是产生水体富营养化的主要因素。在大多数污水处理厂中，氮和磷主要通过活性污泥中功能微生物进行去除，而具有活性的功能微生物的种群占比决定了氮和磷去除效率。荧光原位杂交和高通量核酸测序的最新发展彻底改变了我们对各种自然和工程生态系统中微生物群落多样性的理解。然而，这些技术不能准确地描述功能微生物的活性和微生物群落对时间和生物和非生物环境变化的响应。在污水处理厂中，活性污泥中的功能微生物通过酶来促进生物代谢反应，而酶来自于氨基酸的合成。因此，在活性污泥中具有氨基酸合成蛋白质能力的微生物代表着营养物去除的功能微生物。生物正交氨基酸标记染色法是可以使特定氨基酸进入细胞胞内，进而合成蛋白质。该方法主要应用于单细胞代谢领域，在污水处理领域鲜有报道。
[0003]近年来，通过使用流式细胞术(Flow cytometry，FCM)，海洋和淡水环境中微生物群落的快速特征得到了改善。流式细胞术是一种独立于培养的分析技术，首次开发于20世纪60年代，由于其能够在单细胞水平上快速提供广泛的信息，FCM已成功应用于微生物群落的特征。在过去的十年中，FCM被广泛应用于饮用水水质的评估和监测，并且如今在瑞士作为公认的饮用水分析的指导方法。近几年，越来越多的研究使用FCM来探究传统废水处理厂中不同活性污泥工艺的微生物特点；然而，由于活性污泥工艺的性质，这些研究仅限于废水细菌的检测。而在污水处理中参与废水处理的微生物群落的研究尚未被探索。流式细胞仪分选技术可对感兴趣的细菌群落或者单细胞进行有效分离，并可进一步研究。因此，荧光染色和流式细胞仪分选技术的结合对于研究不同环境矩阵的复杂群落具有非常强大和前景。然而，由于污水处理领域微生物群落的复杂性和多样性，对目的细菌群落特异性染色较复杂，从而无法对感兴趣的微生物进行有效分离。
[0004]本专利技术利用改良的生物正交氨基酸标记染色法联合流式细胞仪分选技术和16SrRNA高通量测序技术检测污水处理系统中功能活性微生物的种群占比；在技术上不同于现有技术，主要体现在以下方面：
[0005](1)现有技术对活性微生物的方法，主要是转录组学；该方法需要提取RNA，对RNA进行逆转录成DNA片段，对DNA片段进行分析从而得出具有转录活性的细菌。由于环境领域的微生物群落比较复杂，导致提取RNA的步骤复杂繁琐；并且RNA作为易降解的物质，在提取和逆转录过程中容易损失，造成检测结果有误。而本专利技术中利用生物正交氨基酸标记染色法标记具有活性的细菌，再通过流式细胞仪分选技术把活性细菌分离出来，不需要提取RNA就可以对活性细菌群落进行有效分离。并且检测过程中被标记的细菌能稳定保存，不存在降解的可能。此外，该方法针对的是某阶段活性细菌，对环境变化较敏感，能准确建立活性
细菌群落与污水环境的响应。
[0006](2)针对某个细菌群落常用的实时定量PCR方法和荧光原位杂交技术和针对大部分细菌常用的高通量测序技术都只能检测某个群落或某个体系所有的微生物，并不能分辨出其中发挥作用的微生物的具体组成，也不能确定环境因素与微生物组成的关系。而本专利技术利用生物正交氨基酸标记染色法使在某种环境条件下具有活性的微生物被标记，进一步被流式细胞仪分选出来，针对是活性细菌的种群分布，表示在活性污泥中实际发挥作用的种群组成。
[0007](3)由于活性污泥体系微生物的复杂性和多样性，传统的染色方法无法区分活性细菌和不具有活性细菌；即使利用多种普通活性染料对细菌染色也很难明显区分细菌阳性区域和阴性区域，并且染料之间存在荧光干扰。而本专利技术中利用点击化学反应促使染料中的炔烃与氨基酸标记物发生反应，这大大促进染料的荧光效果。此外，本专利技术中仅使用单染料对微生物进行染色，被标记的微生物中仅存在多个相同染料分子，不存在荧光干扰问题。
[0008]故本专利技术取污水处理系统中活性污泥微生物，利用改良的生物正交氨基酸标记染色法联合流式细胞仪分选技术和16SrRNA高通量技术来检测活性污泥中活性功能微生物，未见相关研究报道。

技术实现思路

[0009]本专利技术目的是提供了一种经济、简便、可靠的污水处理系统活性污泥中活性功能菌的定量方法。本专利技术利用L
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叠氮高丙氨酸培养污水体系中的某反应阶段的活性污泥；通过点击化学对利用该氨基酸合成蛋白质的微生物进行荧光染色，进入流式细胞仪进行检测，并对异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate，FITC)
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炔烃染料阳性区域进行圈门。通过流式细胞仪分选技术对圈门区域进行分选，得到含有活性功能菌的菌液。菌液在进行深度浓缩后，利用改良的微量DNA试剂盒进行预处理，进而利用苯酚抽提法提取DNA；对提取后的DNA进行16SrRNA高通量测序用来比对分选前和分选后群落，筛选出具有活性功能菌的种群丰度。本专利技术可用于快速监控污水处理系统中活性功能菌的种群丰度和百分含量的动态变化，指导污水处理厂运行调控，具有很好的应用前景。
[0010]本专利技术的技术方案：
[0011](1)取1mL污泥浓度为3000mg/L的活性污泥于离心管中，加入100μL 50mM L
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叠氮高丙氨酸溶液；室温、黑暗条件下，在旋转仪中培养30min；加入1mL质量百分比浓度为8％的多聚甲醛溶液让体系停止反应。在冰上固定3h；固定结束后，加入PBS缓冲液清洗三次；
[0012](2)离心弃掉上清液，利用PBS缓冲液重悬。超声分散细菌种群后，依次往离心管加入体积百分数为50％，80％，96％乙醇溶液进行脱水，晾干样品；(3)往离心管中依次加入215μL PBS缓冲液、15μL 100mM氨基胍盐酸盐溶液；摇匀，反应1min；加入15μL 100mM抗坏血酸钠溶液，摇匀，反应2min；加入5μL染料混合液，在黑暗、室温条件下，培养30min；染料混合液由1μL 1mM异硫氰酸荧光素
‑
炔烃溶液、1.5μL 20mM硫酸铜溶液、2.5μL 50mM三(3
‑
羟丙基三唑甲基)胺溶液配制；在加药完成之后快速摇匀，
[0013]染料混合液在室温、避光条件下反应5min；
[0014](4)染色完成后分别用PBS缓冲液和体积百分数为50％乙醇溶液清洗三次；
[0015]清洗后的样品用30μm滤网过滤，然后利用含有1mM EDTA PBS缓冲液稀释100倍，开
启流式细胞仪，对样品进行检测；
[0016](5)在流式细胞仪设置大小阈值为FSC＝500，收集20000个颗粒，圈门FITC通道显阳性的区域，得到活性功能微生物的百分占比；保持流式细胞仪阈值不变，对其进行分选调整；对FITC通道显阳性区域进行分选，收集2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测活性污泥系统中活性功能菌的方法，其特征在于，过程如下：(1)取1mL污泥浓度为3000mg/L的活性污泥于离心管中，加入100μL 50mML
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叠氮高丙氨酸溶液；室温、黑暗条件下，在旋转仪中培养30min；加入1mL质量百分比浓度为8％的多聚甲醛溶液让体系停止反应；在冰上固定3h；固定结束后，加入PBS缓冲液清洗三次；(2)离心弃掉上清液，利用PBS缓冲液重悬；超声分散细菌种群后，依次往离心管加入体积百分数为50％，80％，96％乙醇溶液进行脱水，晾干样品；(3)往离心管中依次加入215μL PBS缓冲液、15μL 100mM氨基胍盐酸盐溶液；摇匀，反应1min；加入15μL 100mM抗坏血酸钠溶液，摇匀，反应2min；加入5μL染料混合液，在黑暗、室温条件下，培养30min；染料混合液由1μL 1mM异硫氰酸荧光素
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炔烃溶液、1.5μL 20mM硫酸铜溶液、2.5μL 50mM三(3
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羟丙基三唑甲基)胺溶液配制；在加药完成之后快速摇匀，染料混合液在室温、避光条件下反应5min；(4)染色完成后分别用PBS缓冲液和体积百分数为50％乙醇溶液清洗三次；清洗后的样品用30μm滤网过滤，然后利用含有1mM EDTA PBS缓冲液稀释100倍，开启流式细胞仪，对样品进行检测；(5)在流式细胞仪设置大小阈值为FSC＝5...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾薇，孟庆安，刘宏军，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：