一种猪链球菌Ⅱ型双基因缺失菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种猪链球菌Ⅱ型双基因缺失菌株及其应用。所述猪链球菌Ⅱ型双基因缺失菌株的菌种保藏号为：CCTCC NO：M 2023119，命名为：Streptococcus suis

【技术实现步骤摘要】
一种猪链球菌Ⅱ型双基因缺失菌株及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种猪链球菌Ⅱ型双基因缺失菌株及其应用。

技术介绍

[0002]猪链球菌Ⅱ型(StreptococcuSSuiStype2，SS2)，是一种重要的人兽共患病病原。感染猪临床表现为脑膜炎、关节炎、败血症等病症，且能感染人，引发心内膜炎、关节炎、败血性休克等疾病，严重可致死亡。关于猪链球菌Ⅱ型致病因子以及致病机制近年研究取得了很多进展但具体机制仍需深入研究。猪链球菌Ⅱ型致病与细菌黏附、侵袭呼吸道上皮细胞或血管内皮细胞，抗巨噬细胞的吞噬及激活免疫细胞炎症反应等密切相关。猪链球菌表面蛋白能够与人血清中的补体负调节因子相结合，以逃避人体免疫细胞吞噬，从而增强其在血液中的存活能力。猪链球菌Ⅱ型抗巨噬细胞吞噬的成分有荚膜多糖、肽聚糖脱乙酰酶蛋白、超氧化物歧化酶等。超氧化物歧化酶(SuperoxidediSmutaSe
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SodA)是猪链球菌Ⅱ型的重要毒力因子，可清除超氧根离子，增强细菌抗氧化应激的作用。细菌缺失超氧化物歧化酶，对上皮细胞以及内皮细胞黏附能力增高，而在巨噬细胞中存活率显著下降。关于其诱导黏附能力上升的机制，申请人前期初步研究结果显示猪链球菌的硫氧还蛋白2表达上升，而关于硫氧还蛋白是否诱导猪链球菌Ⅱ型的抗氧化能力以及细菌毒力的分子机制无相关报告，仍需进一步研究。

技术实现思路

[0003]本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种猪链球菌Ⅱ型双基因缺失菌株及其应用为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：
[0004]本专利技术通过设计引物扩增TrxB基因的上下游同源臂，将其连接到自杀性质粒pSET4S上构建重组穿梭质粒，再将重组质粒电转化到猪链球菌Ⅱ型ΔSodA单基因缺失菌株中，利用温度与抗性进行筛选，获得一种猪链球菌Ⅱ型ΔSodAΔTrxB双基因缺失菌株。该菌株于2023年2月14日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023119，命名为：Streptococcus suisⅡZJJX081101
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ΔSodA
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ΔTrxB。
[0005]本专利技术的试验结果显示猪链球菌Ⅱ型缺失SodA基因，缺失株相对亲本和回补株对HEp
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2和bEnd.3细胞的黏附能力都显著上升。提取亲本株与ΔSodA株全菌表面蛋白，进行二维电泳，分析了蛋白表达差异。质谱和荧光定量结果分析显示ΔSodA株相对亲本株，硫氧还蛋白表达与转录Thioredoxin
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A(TrxA)和Thioredoxin
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B(TrxB)都显著上升。同时制备了原核表达蛋白TrxA和TrxB，相应的兔多抗，进行免疫印迹验证，结果显示ΔSodA株表达TrxA水平上升不显著，而TrxB蛋白显著上升。
[0006]本专利技术是在猪链球菌Ⅱ型SodA单基因缺失菌株的基础上构建的猪链球菌Ⅱ型ΔSodAΔTrxB双基因缺失菌株，TrxB基因缺失后其毒力大幅度下降，安全水平高，毒性不可逆转，免疫原性高，能够保护免疫猪抵抗猪链球菌Ⅱ型强毒菌株的攻击，且制作工艺简单，成
本低，为有效控制我国猪链球菌病的发生与传播提供了有效帮助。
附图说明
[0007]图1温敏型自杀性质粒pSET4s
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ΔTrxB的构建流程图；
[0008]图2敲除了基因的猪链球菌Ⅱ型突变株的PCR产物电泳图，其中泳道1为DL 5000marker；泳道2为敲除了SodA、TrxB双基因的猪链球菌突变株PCR产物；泳道3为敲除了TrxB基因的猪链球菌突变株PCR产物；泳道4为敲除了Trx1基因的猪链球菌突变株PCR产物；泳道5为敲除了SodA基因的猪链球菌突变株PCR产物；泳道6为野生株阳性对照；
[0009]图3自杀性质粒pSET4s的酶切鉴定结果及引物为SS2
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TrxB
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up
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1F/R与SS2
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TrxB
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Down
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1F/R，扩增TrxB上游片段与下游片段结果，其中泳道1为DL 5000marker；泳道2为pSET4s酶切前；泳道3为pSET4s酶切；泳道8为扩增TrxB的上游片段；泳道9为扩增TrxB的下游片段；
[0010]图4猪链球菌Ⅱ型SodA介导对细胞的黏附与抗吞噬；
[0011]图5SodA基因缺失对猪链球菌Ⅱ型毒力相关因子表达的影响；
[0012]图6猪链球菌Ⅱ型SodA蛋白表达纯化(A)与活性检测(B)硫氧还蛋白TrxA与TrxB原核表达与纯化(C)；
[0013]图7猪链球菌Ⅱ型硫氧还蛋白TrxA与TrxB免疫兔血清抗体效价；
[0014]图8免疫印迹检测SodA缺失株与亲本株蛋白TrxB表达差异。
具体实施方式
[0015]1、菌株、质粒、引物设计
[0016]本专利技术中猪链球菌Ⅱ型分离株1105为浙江省动物预防医学重点实验室于2008年分离自病猪肺脏的强毒株(唐宇龙于2008年11月采集)。pSET4S是温度敏感性自杀质粒，含有壮观霉素抗性基因(Spc)、温度敏感复制子、ColE1复制子、多克隆位点等元件。这些元件使该质粒在大肠杆菌中37℃有壮观霉素的条件下复制；而在猪链球菌中在28℃有壮观霉素的条件下复制，37℃不能复制。根据GeBank中的序列各个分选酶基因的序列，设计Sod、TrxB的两侧设计同源臂，扩增。利用DNAStar软件设计引物见表1。所有引物由北京擎科生物科技有限公司合成。
[0017]表1
[0018][0019]2、猪链球菌Ⅱ型分离株1105感受态细胞的制备
[0020]猪链球菌感受态细胞的制备：取过夜培养的猪链球菌菌液于200mL新鲜的BHI培养基(含40mmol/L DL2苏氨酸)中，37℃250rpm/min振荡，培养至OD≈0.4。将菌液冰浴30min后,4℃离心4000g
×
15min收集菌体，用20mL冰预冷的无菌双蒸水洗涤两次，然后用20mL冰预冷的0.3mol/L蔗糖溶液洗涤两次，最后用20mL冰预冷的0.3mol/L蔗糖+15％甘油溶液洗涤一次，最后将菌体重悬于一定体积的0.3mol/L蔗糖/15％甘油溶液中，使细胞密度达到1.0
×
10
10
CFU/mL左右，分装至EP管100L/每管，
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80℃冻存备用。
[0021]3、pSET4S
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TrxB重组转移质粒的构建(图1)
[0022]构建重组质粒pSET4S
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ΔTrxB：根据NCBI上猪链球菌Ⅱ型05ZYH33的基因(CP000407.1)中的TrxB序列设计引物(见上所示的表1)。从SS2基因组中扩增TrxB基因上下游同源臂TrxB
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up(821bp)和TrxB
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪链球菌Ⅱ型双基因缺失菌株，其特征在于，所述猪链球菌Ⅱ型双基因缺失菌株的菌种保藏号为：CCTCC NO：M 2023119，命名为：Streptococcus suis
ꢀⅡꢀ
ZJJX081101
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ΔSodA
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【专利技术属性】
技术研发人员：唐宇龙，盘艳盈，廖思梦，方丽华，张硕，印遇龙，
申请(专利权)人：中国科学院亚热带农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：