一种铁皮石斛蛋白制备方法、结构表征以及在胃黏膜保护中的应用技术

本发明专利技术公开了一种铁皮石斛蛋白制备方法、结构表征以及在胃黏膜保护中的应用，包括以下步骤：S1.粗蛋白提取：称取100

【技术实现步骤摘要】
一种铁皮石斛蛋白制备方法、结构表征以及在胃黏膜保护中的应用


[0001]本专利技术涉及中药产品研发
，尤其是一种铁皮石斛蛋白制备方法、结构表征以及在胃黏膜保护中的应用。

技术介绍

[0002]中医认为胃黏膜损伤属于“胃脘痛”范畴，胃黏膜损伤的病因目前主要归结于以下几类：(1)温热内蕴：胃部有湿热结于内，时间久了会导致胃气的亏损，脾胃调节不当。(2)饮食调节不当：“饮食自倍，肠胃乃伤”，经常不能按时吃饭的人群极易发生胃肠道疾病。(3)情志调节不当：压力过大、情绪不好、思虑过度等会使肝中的正气留滞，导致胃部疏泄不及。(4)食用刺激性食物：酒精、辣椒、咖啡等。其治疗方法有：健脾益气法
‑
、健脾化瘀法
[6
‑
及针灸疗法。
[0003]现代研究认为，完整的胃黏膜屏障可以有效抵御一部分外来物质的侵袭，由于一些因素尤其是氧化损伤打破了胃黏膜的平衡，在胃黏膜受到侵袭时机体将会失去了自身的保护能力，导致最终的损伤
[11
‑
。
[0004]现在市面上常见的胃药大致分为五类，分别为：抗酸药(如：铝碳酸镁片)、抑酸药(如：奥美拉唑)、胃黏膜保护药(如：枸橼酸铋钾胶囊)、促胃肠动力药(如：多潘立酮片)和抗幽门螺旋杆菌药(如：阿莫西林)，可以有效缓解胃痛、胃胀等，然而诸多的西药长期服用具有一定的副作用和局限性，尤其是目前奥秘拉唑已经成为监管药。
[0005]铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)的茎，,是我国传统的健康食品和中药，《神农本草经》中首次提到石斛，并列为上品:“味甘主伤中、除痹、下气、强阴、补五脏虚劳赢弱、久服厚胃”。铁皮石斛中铁皮石斛多糖为指标性成分，2020版药典指出其指标性成分为甘露糖。现代研究发现铁皮石斛富含石斛活性多糖25％以上。石斛活性多糖有抗肿瘤，消炎，降血压，降血糖，抑制脂质过氧化，抗衰老，加速体质恢复，增加人体内白细胞数目，辅助治疗癌症，增强机体免疫力的作用
[21
‑
22]；同时还具有保湿的功效，现已被当做化妆品中的天然原料，广泛应用于化妆品领域
[23
‑
24]。铁皮石斛还含有石斛碱、菲类化合物、氨基酸等多种营养成分，现代药理实验证明石斛碱有不同程度抑制肿瘤细胞生长及杀生作用，抗肿瘤活性显着，并能通过增强机体免疫力减轻放化疗给机体带来的毒副作用，同时能降低血糖，抗衰老
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‑
28]、菲类化合物具有抗人肺癌细胞和卵巢癌细胞及抗前髓细胞白血病等作用、所含氨基酸达18种之多，可满足机体氨基酸需要，并有抗氧化，抗衰老，降血糖，保肝润肺，软化血管，养胃护胃之保健作用。
[0006]关于铁皮石斛中蛋白质类成分研究的报道，主要集中在蛋白提取方面，活性报道较少。截至目前，国内现有文献未见对铁皮石斛蛋白基于氧化损伤导致的胃粘膜损伤应用方面的报道，且作用机制研究几近空白。
[0007]为此，我们提出一种铁皮石斛蛋白制备方法、结构表征以及在胃黏膜保护中的应用解决上述问题。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种铁皮石斛蛋白制备方法、结构表征以及在胃黏膜保护中的应用，以解决上述
技术介绍
中以往纯乙醇固定液或乙醇类固定液所存在的明显的组织收缩、细胞空泡以及核固缩等缺陷(主要仰仗其高分子的支撑作用)的问题。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0010]一种铁皮石斛蛋白制备方法，包括以下步骤：
[0011]S1.粗蛋白提取
[0012]称取100
‑
300克铁皮石斛放入破碎机中破碎，放入烧杯，向烧杯中加入蒸馏水，料液比为1：(28
‑
35)，用碱性调节剂调节pH为中性左右，提取8
‑
12小时，重复提取2次，提取结束后，以1500
‑
2500r/min的转速离心5
‑
10min，将离心后的液体在
‑
31～25℃低温旋动使结为冰晶，放入冻干机，以
‑
50～
‑
101℃进行真空冷冻干燥，制得铁皮石斛粗蛋白。
[0013]S2.蛋白捕获
[0014]采用阴离子交换柱层析法，先配置不同流动相，流动相A:10
‑
20mmol/LTris
‑
HCl，流动相B:10
‑
20mmol/L Tris
‑
HCl+1
‑
1.5mol/L NaCl，HCl调节pH至中性，将铁皮石斛粗蛋白用流动相A配制成15
ꢀ‑
30mg/mL的溶液，，每次以200mg的铁皮石斛粗蛋白通过DEAE阴离子交换柱。流动相A以6
‑
8mL/min流速洗脱8
‑
10倍柱体积，逐渐增大流动相B的量通过增加盐的浓度进行梯度洗脱(即NaCl浓度范围0
‑
1.5mol/L)，洗脱20
‑
30倍柱体积，最后用流动相B洗脱15
‑
20倍柱体积，逐级将蛋白洗脱下来，如分别在
‑
31～
‑
25℃低温旋动使结为冰晶，放入冻干机，以
‑
50～
‑
101℃进行真空冷冻干燥。
[0015]S3.蛋白脱盐
[0016]冻干后的不同洗脱峰使用超纯水溶解，蛋白溶液体积不超过1/10柱体积,经过G25葡聚糖凝胶脱盐柱脱盐得到铁皮石斛蛋白shpro
‑
2，在
‑
31～
‑
25℃低温旋动使结为冰晶，放入冻干机，以
‑
50～
‑
101℃进行真空冷冻干燥，结合乙醇诱导的原代大鼠胃黏膜细胞模型进行对胃黏膜上皮细胞保护检测，获得具有最佳保护胃黏膜损伤能力的铁皮石斛shpro
‑
2。
[0017]在进一步的实施例中，所述S1步骤粗蛋白提取中铁皮石斛为鲜条、干条及枫斗，碱性调节剂为柠檬酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸氢钾中的一种或多种混合品，在所述S2步骤中，流动相A为15mmol/LTris
‑
HCl，流动相B:12mmol/L Tris
‑
HCl+1.2mol/L NaCl，流动相A流速为7mL/min流速洗脱10倍柱体积，逐渐增大流动相B的量通过增加盐的浓度进行梯度洗脱，洗脱25倍柱体积，最后用流动相B洗脱18倍柱体积。
[0018]一种铁皮石斛蛋白结构表征的研究方法，包括以下方法：
[0019]A)氨基酸分析
[0020]取一定量的铁皮石斛shpro
‑
2样品,水解,采用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法进行样品的衍生，高效液相色谱仪检测，外标法计算供试品的氨基酸组成摩尔百分比。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种铁皮石斛蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.粗蛋白提取称取100
‑
300克铁皮石斛放入破碎机中破碎，放入烧杯，向烧杯中加入蒸馏水，料液比为1：(28
‑
35)，用碱性调节剂调节pH为中性左右，提取8
‑
12小时，重复提取2次，提取结束后，以1500
‑
2500r/min的转速离心5
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10min，将离心后的液体在
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31～25℃低温旋动使结为冰晶，放入冻干机，以
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50～
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101℃进行真空冷冻干燥，制得铁皮石斛粗蛋白；S2.蛋白捕获采用阴离子交换柱层析法，先配置不同流动相，流动相A:10
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20mmol/L Tris
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HCl，流动相B:10
‑
20mmol/L Tris
‑
HCl+1
‑
1.5mol/L NaCl，HCl调节pH至中性，将铁皮石斛粗蛋白用流动相A配制成15
‑
30mg/mL的溶液，，每次以200mg的铁皮石斛粗蛋白通过DEAE阴离子交换柱。流动相A以6
‑
8mL/min流速洗脱8
‑
10倍柱体积，逐渐增大流动相B的量通过增加盐的浓度进行梯度洗脱(即NaCl浓度范围0
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1.5mol/L)，洗脱20
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30倍柱体积，最后用流动相B洗脱15
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20倍柱体积，逐级将蛋白洗脱下来，如分别在
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31～
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25℃低温旋动使结为冰晶，放入冻干机，以
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50～
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101℃进行真空冷冻干燥；S3.蛋白脱盐冻干后的不同洗脱峰使用超纯水溶解，蛋白溶液体积不超过1/10柱体积,经过G25葡聚糖凝胶脱盐柱脱盐得到铁皮石斛蛋白shpro
‑
2，在
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31～
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25℃低温旋动使结为冰晶，放入冻干机，以
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50～
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101℃进行真空冷冻干燥，结合乙醇诱导的原代大鼠胃黏膜细胞模型进行对胃黏膜上皮细胞保护检测，获得具有最佳保护胃黏膜损伤能力的铁皮石斛shpro
‑
2。2.根据权利要求1所述的铁皮石斛蛋白制备方法，其特征在于：所述S1步骤粗蛋白提取中铁皮石斛为鲜条、干条及枫斗，碱性调节剂为柠檬酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸氢钾中的一种或多种混合品，在所述S2步骤中，流动相A为15mmol/L Tris
‑
HCl，流动相B:12mmol/LTris
‑
HCl+1.2mol/L NaCl，流动相A流速为7mL/min流速洗脱10倍柱体积，逐渐增大流动相B的量通过增加盐的浓度进行梯度洗脱，洗脱25倍柱体积，最后用流动相B洗脱18倍柱体积。3.根据权利要求1
‑
2任一项所制备的铁皮石斛蛋白结构表征的研究方法，其特征在于：包括以下方法：A)氨基酸分析取一定量的铁皮石斛shpro
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2样品,水解,采用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法进行样品的衍生，高效液相色谱仪检测，外标法计算供试品的氨基酸组成摩尔百分比；B)紫外可见光吸收光谱配置10mL的1mg/mL铁皮石斛shpro
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2溶液，于紫外分光光度计中以200～800nm范围内全波长扫描；C)红外光谱分析称取2mg的铁皮石斛shpro
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2，将称取的材料放入玛瑙研钵中，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵大庆，王思明，刘美辰，刘诗超，白雪媛，于士婷，潘黛安，
申请(专利权)人：赵大庆，
类型：发明
国别省市：