裂解液在制备囊泡中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种裂解液在制备囊泡中的应用。本发明专利技术研究发现利用红细胞裂解液诱导红细胞以释放“囊泡”的形式死亡，而非细胞胀破；从而可以利用红细胞裂解液诱导RBC产生“囊泡”。。。

【技术实现步骤摘要】
裂解液在制备囊泡中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种裂解液在制备囊泡中的应用。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是细胞分泌的含有蛋白质、核酸及各种细胞因子的纳米级载体。细胞外囊泡可以通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，在细胞间物质传递和信息交流过程中发挥了重要作用。研究发现，细胞外囊泡所介导的信息交流在机体生理或病理过程中发挥了重要的调控作用，涉及到免疫调节、肿瘤生长、血管生成、损伤修复等。
[0003]红细胞，特别是正常的成熟红细胞无核、无细胞器，呈双凹圆碟形，直径7～8μm，中央最薄处仅约1μm，这种特殊的结构有利于增大其表面积以便进行物质交换。红细胞具有可塑变形性，在全身血管中循环运行时，经过变形才能通过口径比它小的毛细血管和血窦孔隙。红细胞膜(RBCm)存在渗透脆性，在低渗溶液中红细胞可发生溶血，利于物质的交换，红细胞膜本身适合在血管内运输。
[0004]红细胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer,或称ACK Lysis Buffer)是一种去除红细胞最简便易行的方法，即用裂解液裂解红细胞，它既不损伤有核细胞又能充分的去除红细胞。裂解液裂解是一种比较温和的红细胞去除方法，主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞，可进一步用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等。

技术实现思路

[0005]一些实施方案中，本专利技术提供了一种裂解液在制备囊泡中的应用。
[0006]一些实施方案中，所述裂解液通过诱导细胞凋亡产生所述囊泡。
[0007]一些实施方案中，所述细胞包括干细胞和红细胞。
[0008]一些实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞。
[0009]一些实施方案中，所述间充质干细胞来源包括：骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜或其组合。
[0010]一些实施方案中，所述裂解液包括红细胞裂解液。
[0011]从现有技术公开显示，红细胞裂解液裂解是一种比较温和的红细胞去除方法，主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞，可进一步用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等。其裂解原理是氯化铵是红细胞裂解液的主要效应物质，氨根离子不能通过细胞膜，而其他离子可以通过，造成细胞内外的离子浓度差异，形成了渗透压差，外部的水分会扩散至细胞内，使红细胞膨胀，达到裂解的效果。可见，目前使用红细胞裂解液裂解的主要目的是去除红细胞。目前研
究领域内对红细胞裂解液的工作原理的认识单一，且一致认为红细胞裂解液的低渗透压使红细胞胀破而死亡，但本专利技术研究发现，在裂解液中的红细胞主要发生形态皱缩，产生囊泡，即以释放“囊泡”的形式死亡，而非细胞胀破；从而可以利用红细胞裂解液诱导RBC产生“囊泡”。
[0012]因而，本专利技术提出了一种新的获取红细胞来源的囊泡的方式，具有较好的应用潜能。
[0013]在一些实施方式中，在目前已有实验数据中发现，这种裂解液产生的囊泡可以有效治疗DSS诱导的小鼠肠炎模型，推测可能具有类似干细胞ApoEVs的治疗效果。红细胞是可获得的来源最广泛的细胞之一，且自体来源数量足够，获取方式便捷。红细胞膜也是生物材料领域应用最广泛的生物膜之一，若本专利技术中“裂解液”方式产生的红细胞囊泡具有优秀的治疗应用价值，将有助于开发“裂解”红细胞产囊泡治疗的新策略以及推动红细胞囊泡在靶向治疗，药物递送等领域的发展，更甚者，成为一种待选的简单高效的临床转化应用方案。
[0014]一些实施方案中，所述诱导时间为1
‑
8小时。
[0015]一些实施方案中，所述诱导时间为2
‑
4小时。
[0016]一些实施方案中，本专利技术提供了一种产囊泡的方法，使用裂解液诱导细胞获得所述囊泡。
[0017]一些实施方案中，所述细胞包括干细胞和红细胞。
[0018]一些实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞。
[0019]一些实施方案中，所述间充质干细胞来源包括：骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜或其组合。
[0020]一些实施方案中，所述裂解液包括红细胞裂解液。
[0021]一些实施方案中，所述诱导时间为1
‑
8小时。
[0022]一些实施方案中，所述诱导时间为2
‑
4小时。
[0023]一些实施方案中，所述方法包括：(1)使用裂解液处理红细胞；(2)分离出囊泡。
[0024]一些实施方案中，所述步骤(2)分离囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡。
[0025]一些实施方案中，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的裂解液上清进行第一次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤(c)中收到到的沉淀进行第四次离心，取沉淀。
[0026]一些实施方案中，所述第一次离心为500
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1500g离心5
‑
30分钟。
[0027]一些实施方案中，所述第一次离心为500
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1000g离心5
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20分钟。
[0028]一些实施方案中，所述第一次离心为500
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900g离心5
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15分钟。
[0029]一些实施方案中，所述第二次离心为1000
‑
3000g离心5
‑
30分钟。
[0030]一些实施方案中，所述第二次离心为1500
‑
2500g离心5
‑
20分钟。
[0031]一些实施方案中，所述第二次离心为1500
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2200g离心5
‑
15分钟。
[0032]一些实施方案中，所述第三次离心为10000
‑
30000g离心15
‑
60分钟。
[0033]一些实施方案中，所述第三次离心为12000
‑
25000g离心20
‑
60分钟。
[0034]一些实施方案中，所述第三次离心为12000
‑
20000g离心20
‑
40分钟。
[0035]一些实施方案中，所述第四次离心为10000
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30000g离心15
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60分钟。
[0036]一些实施方案中，所述第四次离心为12000
‑
25000g离心20
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种裂解液在制备囊泡中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述裂解液通过诱导细胞凋亡产生所述囊泡；优选地，所述诱导时间为1
‑
8小时；优选地，所述诱导时间为2
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4小时；优选地，所述细胞包括干细胞和红细胞；优选地，所述干细胞为间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞来源包括：骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜或其组合。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述裂解液包括红细胞裂解液。4.一种产囊泡的方法，其特征在于，使用裂解液诱导细胞获得所述囊泡。优选地，所述细胞包括干细胞和红细胞；优选地，所述干细胞为间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞来源包括：骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜或其组合；优选地，所述裂解液包括红细胞裂解液。优选地，所述诱导时间为1
‑
8小时；优选地，所述诱导时间为2
‑
4小时；优选地，所述方法包括：(1)使用裂解液处理红细胞；(2)分离出囊泡；优选地，所述步骤(2)分离囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡；优选地，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的裂解液上清进行第一次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：寇晓星，施松涛，曹泽源，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：