一种副猪嗜血杆菌CDT三顺反子及重组CDT的制备方法技术

本发明专利技术公开一种副猪嗜血杆菌CDT三顺反子及重组CDT的制备方法。本发明专利技术首先公开了一种副猪嗜血杆菌CDT三顺反子，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明专利技术进一步公开了副猪嗜血杆菌重组CDT的制备方法。本发明专利技术建立了一种简单有效的副猪嗜血杆菌重组CDT的制备方法，利用副猪嗜血杆菌三个亚基之间天然的基因间隔区序列，构建不含信号肽编码序列的CDT三顺反子，克隆到载体中构建不含信号肽编码序列的三顺反子重组质粒，实现了三个亚基在同一重组大肠杆菌菌株中的同步表达及同步纯化，简化了重组CDT的制备过程，所制备的重组CDT具有良好的生物学活性，为下一步精确研究副猪嗜血杆菌CDT生物学功能奠定了基础。CDT生物学功能奠定了基础。CDT生物学功能奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种副猪嗜血杆菌CDT三顺反子及重组CDT的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
更具体地，涉及一种副猪嗜血杆菌CDT三顺反子及重组CDT的制备方法。

技术介绍

[0002]副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，现也被称为副猪格拉菌(Glaesserella parasuis)，常继发感染于猪病毒性疾病之后，引起以纤维素渗出为特征的多发性浆膜炎、关节炎及脑膜炎等病变，是严重危害生猪养殖业的重要细菌性病原。最早可在2日龄的仔猪鼻腔内检测到该菌的存在，然而通常在断奶后才表现出相关临床症状，且不同分离株的致病性差异较大。尽管对该菌的致病机理进行了广泛研究，但多个环节的致病机制仍不完全清楚。
[0003]细胞致死性膨胀毒素(Cytolethal distending toxin，CDT)广泛存在于多种革兰氏阴性致病菌中，目前已在超过三十种细菌中证实了该毒素的存在。CDT是一种AB型毒素，通常由位于同一操纵子的三个连续阅读框所编码的蛋白形成异源三聚体形式的完整毒素。其中CdtB亚基是该毒素的活性中心，具有类似脱氧核糖核酸酶I的活性，CdtA及CdtC负责与靶细胞结合并辅助CdtB进入真核细胞。目前所发现的CDT的主要功能是破坏真核细胞的染色体DNA，进而打乱细胞的正常分裂周期，通常使细胞分裂停留在G2/M期，并引起细胞凋亡，与CDT作用后真核细胞主要表现为体积明显增大3
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5倍。CDT三个亚基都拥有信号肽，切割信号肽后形成成熟的蛋白亚基，通过自组装的方式形成完整的三聚体毒素，进而被分泌到细菌所在的外部环境中。只有三个亚基形成的三聚体完整毒素，才能充分发挥CDT的生物学活性，制备出高纯度的完整的重组CDT是在体外研究其功能的前提条件。
[0004]常规制备方法需要将三个亚基分别克隆至原核表达质粒，分别进行蛋白表达并纯化，再进行体外组装，步骤比较繁琐。
[0005]因此，需要提供一种简单的构建完整重组CDT的方法，以解决本专利技术上述问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个目的在于提供能在大肠杆菌中同步表达CdtA、CdtB和CdtC三个亚基的副猪嗜血杆菌CDT三顺反子。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供一种简单有效完整的副猪嗜血杆菌重组CDT的制备方法，所制备的CDT具有良好的生物学活性。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0009]本专利技术首先提供了一种副猪嗜血杆菌CDT三顺反子，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0010]本专利技术所述副猪嗜血杆菌CDT三顺反子包括SEQ ID NO.1第1
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624位所示的不含信号肽编码序列的cdtA、SEQ ID NO.1第633
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1406位所示的不含信号肽编码序列的cdtB和SEQ ID NO.1第1417
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1890位所示的不含信号肽编码序列的cdtC三个亚基及SEQ ID NO.1第625
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632位所示的cdtA与cdtB基因间隔序列和SEQ ID NO.1第1407
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1416位所示的cdtB与cdtC基因间隔序列。
[0011]包含上述副猪嗜血杆菌CDT三顺反子的重组质粒或重组微生物也在本专利技术的保护范围之内。
[0012]进一步，所述重组微生物的宿主细胞为大肠杆菌。
[0013]本专利技术上述副猪嗜血杆菌CDT三顺反子的重组质粒的构建方法包括如下步骤：
[0014]以副猪嗜血杆菌的基因组为模板，分别以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对和SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物对为引物进行PCR扩增，得到不含信号肽编码序列的cdtA、cdtB及cdtC基因的PCR产物；
[0015]通过重叠PCR技术将不含信号肽编码序列的cdtA、cdtB及cdtC基因的PCR产物连接得到重叠PCR产物，简称为tABC；
[0016]利用Nco I和Xho I分别对tABC和pET 28a质粒进行双酶切后连接，将tABC克隆至pET 28a质粒中，得到副猪嗜血杆菌CDT三顺反子重组质粒pET
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tABC，所述副猪嗜血杆菌CDT三顺反子重组质粒pET
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tABC中包含上述副猪嗜血杆菌CDT三顺反子。
[0017]本专利技术进一步还提供了上述副猪嗜血杆菌CDT三顺反子、重组质粒或重组微生物在制备副猪嗜血杆菌重组CDT中的应用。
[0018]本专利技术副猪嗜血杆菌重组CDT的制备方法包括如下步骤：
[0019]将上述副猪嗜血杆菌CDT三顺反子的重组质粒pET
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tABC进行原核表达和纯化同时得到CdtA、CdtB及CdtC
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his蛋白；
[0020]将CdtA、CdtB及CdtC
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his蛋白进行组装后纯化得到以CdtA/CdtB/CdtC
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His三聚体形式存在的副猪嗜血杆菌重组CDT。
[0021]为了尽量减少组氨酸标签(6
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His纯化标签)对重组CDT三聚体组装及后续亲和层析纯化的影响，本专利技术探索了将上述组氨酸标签分别表达在CdtA、CdtB或CdtC亚基的羧基端，发现将组氨酸标签表达在CdtB蛋白的羧基端对CDT组装及纯化的影响最大，可能是CdtB亚基的羧基端处于完整CDT毒素三聚体的中心位置，所以组氨酸标签的加入所形成的位阻现象会影响三聚体的形成，最终将组氨酸标签表达在CdtC蛋白的羧基端进行组装，组装效果最好。
[0022]进一步，所述原核表达为将重组质粒pET
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tABC转化进入大肠杆菌Rosetta感受态，培养并诱导表达。
[0023]进一步，所述培养为将转化入重组质粒pET
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tABC的大肠杆菌Rosetta感受态涂布在卡那霉素抗性平板上，挑取2
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3个单菌落在LB液体培养基培养至OD600值达到0.4
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0.6时。
[0024]进一步，所述诱导表达为加入终浓度0.5mM IPTG诱导表达。
[0025]进一步，所述组装是CdtA、CdtB及CdtC
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his蛋白以浓度0.1mg/ml溶解于包含0.01M PBS的包涵体溶解液中，经尿素浓度梯度透析进行组装。
[0026]副猪嗜血杆菌CDT三个亚基成熟蛋白的等电点差别明显，CdtA、CdtB及CdtC的等电点分别为5.10、9.19及6.96，很难协调三个亚基在特定pH值溶液中都有较好的溶解度，这是在体外实现较高蛋白浓度下的CDT三聚体制备过程中的难点。如果在较低的蛋白浓度下进行CDT三聚体制备，又会为后续的纯化工作增加难度。因此，本专利技术对组装时的缓冲体系进行了优化，前述研究表明通过添加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种副猪嗜血杆菌CDT三顺反子，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌CDT三顺反子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌CDT三顺反子，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌CDT三顺反子包括SEQ ID NO.1第1
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624位所示的不含信号肽编码序列的cdtA、SEQ ID NO.1第633
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1406位所示的不含信号肽编码序列的cdtB和SEQ ID NO.1第1417
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1890位所示的不含信号肽编码序列的cdtC三个亚基及SEQ ID NO.1第625
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632位所示的cdtA与cdtB基因间隔序列和SEQ ID NO.1第1407
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1416位所示的cdtB与cdtC基因间隔序列。3.包含权利要求1或2所述的副猪嗜血杆菌CDT三顺反子的重组质粒或重组微生物。4.一种副猪嗜血杆菌CDT三顺反子的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以副猪嗜血杆菌的基因组为模板，分别以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对和SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物对为引物进行PCR扩增，得到不含信号肽编码序列的cdtA、cdtB及cdtC基因的PCR产物；通过重叠PCR技术将不含信号肽编码序列的cdtA、cdtB及cdtC基因的PCR产物连接得到重叠PCR产物，简称为tABC；利用Nco I和Xho I分别对tABC和pET 28a质粒进行双酶切后连接，将tABC克隆至pET 28a质粒中，得到副猪嗜血杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：李军星，袁秀芳，余斌，徐丽华，苏菲，叶十一，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：