籼稻ALS突变型蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了籼稻ALS突变型蛋白及其编码基因与应用，涉及生物技术、作物遗传育种领域。本发明专利技术采取多重复合诱变以及除草剂筛选育种，结合了辐射诱变和EMS诱变，同时进行了除草剂多浓度梯度浸种和叶片喷施的筛选，获得了具有除草剂抗性的籼稻ALS突变体植株，经过测序验证，确认了突变株植株的位点变异、籼稻ALS突变蛋白和编码基因，获得了籼稻具有ALS抑制类除草剂抗性的新位点，提供了一套快速筛选、鉴定后代抗除草剂植株的新方法，并提供了一种有效防治籼稻草害的方法。全球80％的稻米生产基于籼稻，抗除草剂籼稻的抗草害种植具有极大的应用价值。用价值。

【技术实现步骤摘要】
籼稻ALS突变型蛋白及其编码基因与应用


[0001]本专利技术属于生物技术、作物遗传育种领域，具体涉及籼稻ALS突变型蛋白及其编码基因与应用。

技术介绍

[0002]草害是影响水稻产量的重要因素之一，杂草与作物竞争水、阳光、土壤等生存资源的同时，抑制植株生长、结实，降低稻谷品质、产量，造成严重经济损失。同时，随着水稻直播方式越来越广泛的应用，杂草稻(又称杂草型稻，也称为伴生型杂草)，已经成为水稻生产过程中主要的草害，严重时可减产60％以上。这是因为在直播过程中，由于杂草稻种子和水稻种子处在一个同时生长的过程，杂草稻一般株高较高，分蘖力强，生长繁茂，根系发达，它通过与栽培稻争夺阳光、水分和养分从而制约水稻产量的提高。另一方面，由于杂草稻的稻米碎米多、颜色不均匀，容易造成稻米特别是糯米的污染，使得稻米的整体商品性下降。同时，生产水稻种子需要保证较高的种子纯度，杂草稻的出现显然不利于水稻种子生产。这些都给稻作生产者造成极大的经济损失，杂草稻的防除尤为急迫。
[0003]随着城镇化速度的加快和现代农业的发展，水稻生产正在向集约化、规模化、机械化发展，随着机种、机收面积的增加，传统的深耕、灌水诱发灭杀、轮作换茬、人工拔除等除草方法因耗时费力逐渐被化学除草取代，化学除草现已成为控制草害的主要手段。
[0004]常见的化学除草剂，包括有磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类等除草剂，目前已经大面积商业推广使用。然而，由于这些除草剂通常也能杀死农作物本身，因此，对一般不具有除草剂抗性(耐受性)的农作物而言，除草剂的使用在时间和空间上受到了极大限制，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂。而且，由于杂草稻与栽培稻在解剖学和生理特性上具有相似性，且杂草稻变异类型多样，更是在一定程度上限制了通过除草剂控制杂草稻的应用。为此，人们研究开发具有除草剂抗性(耐受性)的水稻，这样可以在种植期间使用除草剂，杀死杂草，但不影响水稻本身的生长，由此拓宽了除草剂的使用范围。如此，选育或改良具有特异性除草剂抗性的水稻品种，与化学除草剂联用控制草害效果较好，成为杂草防治的有效方法。
[0005]不同的化学除草剂具有不同的杀草谱，在实际生产中应用广泛的咪唑啉酮类除草剂是一类广谱除草剂，包括唑烟酯、咪唑乙烟酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草烟、甲基咪草烟和咪草酸。咪唑啉酮类除草剂通过与植物体内的靶标酶乙酰乳酸合酶(acetolactatesynthase，ALS)结合形成复合物阻断底物进入酶活性位点通路，抑制ALS活性，使植物体内的支链氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的合成受阻，使杂草的芽和根快速停止生长，使得组织失绿、黄化，最终导致植物死亡，进而达到除草的目的。抗性机制研究表明，植物ALS基因保守区发生错义突变会导致酶结构或空间构象发生变化，降低对除草剂的亲和力，进而产生抗性。
[0006]研究显示，大约由670个氨基酸组成的成熟的ALS蛋白中，至少有20个氨基酸突变位点导致植物对ALS抑制剂类除草剂产生抗性，但是，在这些ALS抑制剂突变位点中只有部分位点在水稻中已经证明可产生除草剂抗性。国外学者首先获得了抗ALS抑制剂水稻品种。
美国科学家利用甲磺酸乙酯(Ethyl Methanesulfonate,EMS)诱变水稻品种AS3510，咪唑乙烟酸喷施M2植株，筛选出具有咪唑啉酮类除草剂抗性的突变系93AS3510，并进一步与品种Cocodrie和MayBelle杂交，选育出抗性品种CL121与CL141，已在2001获得批准大量种植。对水稻品种Cypress也使用同样的方法处理，筛选出抗性品系PWC16，系统选育出品种CL161，并逐步取代CL121和CL141。DNA测序表明，93AS3510和PWC16突变体的ALS基因均为单碱基突变，导致对除草剂出现抗性，其中93AS3510的突变是Gly654Glu，而PWC16的突变是Ser653Asn。中国研究人员对水稻品种9311种子进行EMS诱变和除草剂筛选，得到优良粳稻矮秆品种JD164，并鉴定出该突变与PWC16材料的突变位点一致，对IMI类除草剂具有专一耐受性，对咪唑乙烟酸的抗性浓度为500mg/L。通过津稻9618和津稻1007杂交以及多年系谱法选育得到抗IMI的金粳818，推测可能是水稻与大豆轮作田中发生的天然突变体，经鉴定该突变与PWC16的突变位点一致，对咪唑乙烟酸的抗性浓度达70g/hm2。
[0007]综上，ALS突变体抗除草剂水平与ALS氨基酸突变的位置、突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目等有关，而且，不同遗传背景下相同位置的氨基酸变异产生的除草剂抗性效应也会存在显著差异。由于ALS抑制类除草剂的作用机理尚未明确，很难预测在某个特定遗传背景下的植物ALS蛋白是否发生突变、突变位点在何处、突变是否会产生ALS抑制类除草剂抗性，以及该突变位点的抗性水平是否具有生产应用价值。例如，目前籼稻和粳稻是栽培稻的两大亚种，全球80％的稻米生产基于籼稻，比较粳稻品种日本晴和籼稻品种黄华占的相关序列，发现在这两种籼、粳稻ALS编码区序列存在29处核苷酸变异，其中4处能导致氨基酸序列变异的错义突变。这意味着，在粳稻的某些位点发生抗除草剂活性突变，未必就能在籼稻的相同位点上实现具有抗除草剂活性的突变。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种籼稻ALS突变蛋白及其编码基因与应用，该ALS突变蛋白使籼稻具有抗咪唑啉酮类除草剂活性，可通过多重诱变和筛选来培育出具有表达所述蛋白的抗ALS抑制类除草剂的籼稻品种。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：
[0010]在本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种具有除草剂抗性的籼稻ALS突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
[0011]同时，本专利技术提供了编码所述具有除草剂抗性的籼稻ALS突变蛋白的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
[0012]在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种具有除草剂抗性的籼稻，其表达如权利要求1所述的ALS突变型蛋白，或者含有如权利要求2所述的核酸或基因。
[0013]在本专利技术的第三方面，本专利技术提供了上述具有除草剂抗性的籼稻的育种方法，包括以下步骤：
[0014](1)选取籼稻特糯2072干种子作为辐射处理的材料，用辐射剂量为100Gy的
60
Coγ射线辐照诱变，种子量不低于500g；
[0015](2)将经步骤(1)处理的干种子在甲磺酸乙酯诱变溶液中浸泡2小时后取出、沥干；然后，将上述得到的种子浸泡在由体积比为1:1的甲磺酸乙酯诱变溶液与硫代硫酸钠溶液组成的混合液中处理24小时后取出；再用硫代硫酸钠溶液涮洗种子，放置15分钟后取出，用
自来水冲洗种子4～6小时，得到诱变处理的M1种子；所述的甲磺酸乙酯诱变溶液是将甲磺酸乙酯加入到pH为7的磷酸缓冲液中配制得到的，所述的甲磺酸乙酯诱变溶液中甲磺酸乙酯的体积浓度为0.5％；
[0016](3)将M1种子进行播种移栽，按群体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有除草剂抗性的籼稻ALS突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。2.编码如权利要求1所述的具有除草剂抗性的籼稻ALS突变蛋白的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。3.一种具有除草剂抗性的籼稻，其特征在于，其表达如权利要求1所述的ALS突变型蛋白，或者含有如权利要求2所述的核酸或基因。4.如权利要求3所述的具有除草剂抗性的籼稻的育种方法，包括以下步骤：(1)选取籼稻特糯2072干种子作为辐射处理的材料，用辐射剂量为100Gy的
60
Coγ射线辐照诱变，种子量不低于500g；(2)将经步骤(1)处理的干种子在甲磺酸乙酯诱变溶液中浸泡2小时后取出、沥干；然后，将上述得到的种子浸泡在由体积比为1:1的甲磺酸乙酯诱变溶液与硫代硫酸钠溶液组成的混合液中处理24小时后取出；再用硫代硫酸钠溶液涮洗种子，放置15分钟后取出，用自来水冲洗种子4～6小时，得到诱变处理的M1种子；所述的甲磺酸乙酯诱变溶液是将甲磺酸乙酯加入到pH为7的磷酸缓冲液中配制得到的，所述的甲磺酸乙酯诱变溶液中甲磺酸乙酯的体积浓度为0.5％；(3)将M1种子进行播种移栽，按群体混收M2种子；(4)将M2种子浸泡于浓度为1:200的咪唑乙烟酸溶液中48h后，直播种植，为M2群体；待存活秧苗长到四叶一心期，选择浓度为1:150的咪唑乙烟酸溶液对叶片进行喷施，筛选出能正常生长并结实的单株作为除草剂抗性突变株，按单株收获得到M3种子并按植株进行编号；(5)将单株收获的M3种子浸泡于浓度为1:200的咪唑乙烟酸溶液中48h后，按编号分小区播种，为M3群体；待存活秧苗长到四叶一心期，选择浓度为1:150的咪唑乙烟酸溶液对叶片进行喷施，按小区分别取植株叶片与原始亲本籼稻特糯2072植株叶片进行SSR指纹比对，筛选出与原始亲本差异位点≤1的小区植株，并与原始亲本进行各项农艺性状对比筛选，获得具有原始亲本品种的性状且抗除草剂的籼稻品种。5.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于，pH为7的磷酸缓冲液是由体积比为5：3的浓度为0.2mol/L的Na2HPO4和浓度为0.2mol/L的NaH2PO4组成。6.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于，步骤(2)中，与所述甲磺酸乙酯诱变溶液混合的硫代硫酸钠溶液的浓度为200m...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪庆，郭芾，钱秋，舒庆尧，谭瑗瑗，张岳晓，浦炳峰，冯云艳，邓丽，
申请(专利权)人：浙江大学海南研究院，
类型：发明
国别省市：