一种检测转录因子的双模方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种检测转录因子的双模方法，将连接β

【技术实现步骤摘要】
一种检测转录因子的双模方法及应用


[0001]本专利技术为传感检测
，它涉及一种基于DNA特定序列的特异性识别产生DNA聚合酶抗性的发夹，启动杂交链反应(HCR)和激活CRISPR/Cas12a切割酶系统进行级联信号扩增，并通过传感界面的β
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半乳糖苷酶(β
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gal)和两底物实现双信号传导的策略来检测转录因子。

技术介绍

[0002]转录因子(TFs)是真核生物蛋白质组中最重要的一类DNA结合蛋白。它附着在基因组DNA的特定序列上，以调节基因转录的速率。据估计，人类基因组中约有1600个转录因子，其中约19％的基因已被发现与癌症、自身免疫、糖尿病和心血管疾病等疾病有关。因此，转录因子的定量检测在临床诊断和生物医学研究中具有重要意义。为了提高检测灵敏度，这些方法通常采用基于核酸的信号转导和扩增策略。从已公开的工作来看，外切酶III(ExoIII)的防护是最常用的策略。理论上，双链DNA探针与TFs结合形成TFs
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DNA复合物，经ExoIII消化后产生单链尾，触发滚圈扩增(RCA)或杂交链反应(HCR)。然而，ExoIII与TFs
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DNA复合体有一定的结合，引起不期望的DNA切割，导致传感灵敏度下降。因此，仍需要更稳健的信号转导策略来检测转录因子。
[0003]聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白(Cas)系统是原核生物中的适应性免疫系统，已成为基因组编辑的革命性工具。它在转录调控、基因组工程和遗传疾病治疗等多个领域具有广阔的应用前景。除了基因编辑外，Cas系统在生物传感领域的应用也成为近年来研究的热点。由于Cas系统具有精确的序列识别能力和对单链DNA的高反式切割内切酶活性，可以灵活地与各种核酸扩增技术组合，为提高Cas生物传感性能提供了一种有效的途径。
[0004]便携式及小型化的个人血糖计(PGM)已被开发用于现场检测各种目标对象。典型的基于PGM的策略，通常将靶标扩增和信号转导相结合。对于将非葡萄糖底物催化转化为葡萄糖实现信号转导的酶，现开发应用的种类仅包括a
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葡萄糖苷酶、转化酶、碱性磷酸酶(ALP)、己糖激酶和葡萄糖氧化酶。此外，由于PGM的检测信号受测试条件、检测环境和器件效率所影响，因此，将基于PGM的分析与基于精密仪器的方法相结合，可提供比单一读数更准确、更可靠的检测结果。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种检测转录因子的双模方法，通过DNA特定序列的特异性识别，启动杂交链反应(HCR)和激活CRISPR/Cas12a切割酶系统进行级联信号扩增，利用β
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半乳糖苷酶(β
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gal)和两底物转导双信号，采用有色法和便携式血糖糖计监测双信号，从而实现检测转录因子的目的。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案：一种检测转录因子的双模方法，包括以下步骤：
[0007](1)H1发夹的设计
[0008]H1包括一段短的发夹环序列，一段可启动杂交链反应的5'端单链序列。一段可识别目标转录因子的互补双链序列。
[0009](2)生物素化β
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半乳糖苷酶(bio
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β
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gal)的制备
[0010]将NHS
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LC
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生物素与β
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gal加入超滤离心管，室温反应后。反应液离心分离，洗涤多次。最后，将bio
‑
β
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gal分散到超纯水中保存，以备后续研究。
[0011](3)目标TFs引发的杂交链反应
[0012]所有H1、H2和H3发夹链溶解于合适缓冲液，95℃退火，70℃培养，然后缓慢冷却。不同浓度的TFs与一定浓度的H1反应形成TFs
‑
H1复合物。添加klenow酶和dNTPs，37℃培育，延伸H1的3
′
端补齐H1发夹。然后，灭活TFs和klenow酶,TFs
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H1复合物中的H1解离。最后加入等摩尔比的H2和H3，室温孵育24h进行杂交链反应。
[0013](4)传感界面的构建
[0014]首先，将壳聚糖溶液滴入96孔板的孔中干燥成膜。然后加入戊二醛，活化。洗去多余的戊二醛，加入P1探针培育，用牛血清蛋白阻断活性位点。然后用链霉亲和素与标记在P1末端的生物素反应，洗掉未结合的亲和素。随后，补充bio
‑
β
‑
gal，常温培育。通过功能化过程，将β
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gal固定在界面，用于ONPG显色反应和葡萄糖的生成。
[0015](5)TFs的双模检测
[0016]在Cas12a的工作缓冲液中，将Cas12a与crRNA混合培育制备Cas12a
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crRNA复合物，将制备的Cas12a
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crRNA和杂交链反应产物加入(4)处理的96孔板的孔中，切割P1，洗去Cas12a反应液，加入含ONPG的磷酸盐缓冲液。45℃孵育，在410nm处测定吸光度。对于基于血糖计的检测，加入含乳糖的溶液培育，用商用血糖计检测产生的葡萄糖浓度。绘制目标TFs标准浓度与双信号强度的标准曲线；根据标准曲线，计算待测样品中TFs的含量。
[0017]步骤(1)中所述的H1，靠近3'端的茎，包含可识别目标转录因子的互补双链序列，根据识别目标不同，序列可调；靠近5'端的尾，包含可启动杂交链反应的单链序列。
[0018]步骤(2)中所述的NHS
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LC
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生物素的质量浓度为1.0～10.0mg/mL，β
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gal的浓度为5.0～40.0mg/mL，室温反应温度为0.5～5h。
[0019]步骤(3)中所述的发夹链摩尔浓度为10～100nmol/L，dNTP的浓度为2.5～50mmol/L，klenow聚合酶的活性浓度为50～500U/mL。
[0020]步骤(4)中所述壳聚糖比分比浓度为0.1～1％，戊二醛的浓度为0.2～2.5％，P1探针的摩尔浓度为0.2～5μmol/L，链霉亲和素的质量浓度为0.1mg/mL。
[0021]步骤(5)中所述的Cas12a与crRNA的摩尔比为1:1～5，ONPG的浓度为1～10mmol/L，乳糖浓度为20～50mmol/L。
[0022]步骤(3)、(4)、(5)中所述温度为35～45℃；反应时间为10～200min；步骤(3)中所述的klenow聚合酶的浓度为50～200U/mL；dNTP的浓度为2.5～20mmol/L。
[0023]本专利技术先设计结合转录因子特定核酸序列的发夹H1，当目标转录因子(TFs)存在时，TFs与H1结合，形成TFs
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H1复合物。然后klenow酶将剩余的H1的3'端延伸补齐。而TFs
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H1复合体中，由本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测转录因子的双模方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)H1发夹的设计H1包括一段短的发夹环序列，一段可启动杂交链反应的5'端单链序列；一段可识别目标转录因子的互补双链序列；(2)生物素化β
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半乳糖苷酶(bio
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β
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gal)的制备将NHS
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LC
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生物素与β
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gal加入超滤离心管，室温反应后；反应液离心分离，洗涤多次；最后，将bio
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β
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gal分散到超纯水中保存，以备后续研究；(3)目标TFs引发的杂交链反应所有H1、H2和H3发夹链溶解于合适缓冲液，95℃退火，70℃培养，然后缓慢冷却；不同浓度的TFs与一定浓度的H1反应形成TFs
‑
H1复合物；添加klenow酶和dNTPs，37℃培育，延伸H1的3
′
端补齐H1发夹；然后，灭活TFs和klenow酶,TFs
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H1复合物中的H1解离；最后加入等摩尔比的H2和H3，室温孵育24h进行杂交链反应；(4)传感界面的构建首先，将壳聚糖溶液滴入96孔板的孔中干燥成膜；然后加入戊二醛，活化；洗去多余的戊二醛，加入P1探针培育，用牛血清蛋白阻断活性位点；然后用链霉亲和素与标记在P1末端的生物素反应，洗掉未结合的亲和素；随后，补充bio
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β
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gal，常温培育；通过功能化过程，将β
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gal固定在界面，用于ONPG显色反应和葡萄糖的生成；(5)TFs的双模检测在Cas12a的工作缓冲液中，将Cas12a与crRNA混合培育制备Cas12a
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crRNA复合物，将制备的Cas12a
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crRNA和杂交链反应产物加入(4)处理的96孔板的孔中，切割P1，洗去Cas...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓克勤，钱欣梅，张衡，李春香，
申请(专利权)人：湖南科技大学，
类型：发明
国别省市：