本发明专利技术公开了鉴定3种益母草属植物的分子标记、引物及其应用，属于植物分子鉴定技术领域。本发明专利技术分子标记包括分子标记1和/或分子标记2；分子标记1包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，分别包括6个SNP位点；分子标记2包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，其中包括10个SNP位点和2个InDel位点。分子标记引物包括分子标记引物3、4、5、6；其中分子标记引物3包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，分子标记引物4包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，分子标记引物5包括SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，分子标记引物6包括SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。利用本发明专利技术分子标记能够有效鉴定益母草、欧益母草和细叶益母草，进而避免三者混淆，保证用药的安全性、有效性。性。性。
【技术实现步骤摘要】
鉴定3种益母草属植物的分子标记、引物及其应用
[0001]本专利技术属于植物分子鉴定
，具体涉及鉴定3种益母草属植物的分子标记、引物及其应用。
技术介绍
[0002]唇形科有10个亚科，约220余属，3500余种，益母草属约20种，分布于欧洲、亚洲温带，少数种在美洲、非洲各地，中国有12种，分布甚广，其中益母草、欧益母草和细叶益母草较为常见，具有相似却又不同的医药应用：益母草（Leonurus japonicus）供药用，子名茺蔚，全草入药，有效成分为益母草素（Leonurin），广泛用于治疗妇女闭经、痛经、月经不调、产后出血过多、恶露不尽、产后子宫收缩不全、胎动不安、子宫脱垂及赤白带下等症；欧益母草（Leonurus cardiaca）原产欧洲和西亚的土耳其，具有治疗心脏病、高血压、甲亢、格雷夫斯病、焦虑、失眠、更年期、产后并发症、瘙痒、带状疱疹、胀气和月经不调等疾病；细叶益母草（Leonurus sibiricus）分布于中国的内蒙古、河北北部、山西、陕西北部、黑龙江省、吉林、辽宁和内蒙古等地，其全草及果实入药，可治疗月经不调、痛经、经闭、恶露不尽、水肿尿少、小腹胀痛、跌打损伤、肝热头痛、目赤肿痛、角膜云翳等症。从药理作用和功效来看，3种植物的差异和治疗疾病既有相似但又有明显的区别。
[0003]上述3种植物在盛花期可通过形态学特征（如花色）进行有效区分：如图1
‑
3分别为益母草（花桃红色）、欧益母草（花粉紫色）和细叶益母草（花粉红色）；但若是在植物苗期直至未开花阶段，三者外在形态非常类似且容易混淆，一旦误认错认误用会造成药用有效性及安全性的隐患。
[0004]因此，如何结合外观并基于上述3种植物的内在基因组特征进行有效鉴别是本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
[0005]本专利技术公开了鉴定3种益母草属植物的分子标记，根据该分子标记设计特异性引物对待鉴定样品进行扩增、测序，即可实现益母草、欧益母草和细叶益母草的有效鉴定。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：提供鉴定3种益母草属植物的分子标记：3种益母草属植物包括益母草、欧益母草和细叶益母草；所述分子标记包括分子标记1和/或分子标记2，所述分子标记1包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，包括6个SNP位点，SEQ ID NO：1为：THGKTTTCTATCGRATMYAWA，其中，SNP位点为5
’
端第197/209/213位碱基G/A/A（用于鉴别益母草）、第199/212/215位碱基C/A/G（用于鉴别欧益母草），第197/199/209/212/213/215位碱基T/T/T/C/T/A（用于鉴别细叶益母草）；所述分子标记2包括SEQ ID NO：2 所示核苷酸序列，其中包括10个SNP位点和2个InDel位点，
SEQ ID NO：2为：TKTHAMARAAPACXTGNGATCTGKGY
‑
ZTT，其中，SNP位点为5
’
端第266位碱基为T（用于鉴别益母草），第241/243/265/267位碱基分别为G/T/T/A（用于鉴别欧益母草）、第245/247/250/253/256/263/267位碱基分别为A/A/A/C/G/G/A（用于鉴别细叶益母草）；其中，InDel位点为5
’
端第265位碱基T或A的缺失（用于鉴别细叶益母草），第266位碱基的缺失（用于三种益母草的鉴别）。
[0007]本专利技术对益母草属三种植物益母草、欧益母草和细叶益母草的质体基因组通过软件mVISTA(http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml)进行基因组的比较分析，且应用EMBOSS（v6.3.1）结合K2p参数的进化模式鉴定基因组序列中的高可变区，有效发现72个基因间区，其中应用PCR扩增技术对2个高K2p的基因间区（atpH
‑
atpI：M1和rps15
‑
ycf1：M2），即分子标记M1和M2应用引物对进行扩增和测序，并对三种植物的分子标记扩增产物M1和M2分别比对，发现atpH
‑
atpI中开发的分子标记M1有6个特定的可变SNP位点；而rps15
‑
ycf1中开发的分子标记M2具有10个SNP位点和2个Indel位点。当单独或者结合使用两个M1和M2两个标记的SNP和InDel位点时，3个益母草属的物种益母草、欧益母草和细叶益母草均可以被成功地区分开。
[0008]鉴定3种益母草属植物的引物：3种益母草属植物包括益母草、欧益母草和细叶益母草；引物组1用于扩增含分子标记1的序列，包括：上游引物： 5
’‑ꢀ
CACACGTCGTAAAATTGAATCACAC
‑3’
，SEQ ID NO：3；下游引物： 5
’‑
GCTTAGCGCAAAGCAATGTATGC
ꢀ‑3’
，SEQ ID NO：4；引物组2用于扩增含分子标记2的序列，包括：上游引物： 5
’‑ꢀ
CAGATATGGATTTTACCGATCAG
‑3’
，SEQ ID NO：5；下游引物： 5
’‑ꢀ
GCAAACAAATACACAGATCAC
‑3’
，SEQ ID NO：6。
[0009]上述分子标记或上述引物用于3种益母草属植物的鉴定：益母草，SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第197/209/213位SNP位点碱基分别为G/A/A，SEQ ID NO：2所示核苷酸序列第265位碱基缺失InDel位点，266位碱基为T；欧益母草，SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第199/212/215位SNP位点的碱基分别为C/A/G；SEQ ID NO：2所示核苷酸序列第241/243/265/267位碱基分别为G/T/T/A；细叶益母草，SEQ ID NO：2所示核苷酸序列第245/247/250/253/256/263/267位碱基分别为A/A/A/C/G/G/A；SEQ ID NO：2所示核苷酸序列第265位为InDel缺失位点，266位碱基T或A的缺失。
[0010]鉴定3种益母草属植物的试剂盒：3种益母草属植物包括益母草、欧益母草和细叶益母草；试剂盒包括上述引物。
[0011]鉴定3种益母草属植物的方法，包括如下步骤：（1）取待检测样品，提取基因组DNA；（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，使用上述引物进行PCR扩增；（3）对步骤（2）扩增产物进行测序，根据测序结果区分益母草、欧益母草和细叶益母草。
[0012]进一步地，步骤（2）中扩增体系为：
2
×
Taq PCR Master Mix 12.5
ꢀµ
L，每种引物1.0
ꢀµ
L，模板DNA 2.0
ꢀµ
L，加ddH2O至最终体积为25.本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.鉴定3种益母草属植物的分子标记，其特征在于，所述3种益母草属植物包括益母草、欧益母草和细叶益母草；所述分子标记包括分子标记1和/或分子标记2，所述分子标记1包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，包括6个SNP位点，SEQ ID NO：1为：THGKTTTCTATCGRATMYAWA，其中，SNP位点为5
’
端第197/209/213位碱基G/A/A（用于鉴别益母草）、第199/212/215位碱基C/A/G（用于鉴别欧益母草），第197/199/209/212/213/215位碱基T/T/T/C/T/A（用于鉴别细叶益母草）；所述分子标记2包括SEQ ID NO：2 所示核苷酸序列，其中包括10个SNP位点和2个InDel位点，SEQ ID NO：2为：TKTHAMARAAPACXTGNGATCTGKGY
‑
ZTT，其中，SNP位点为5
’
端第266位碱基为T（用于鉴别益母草），第241/243/265/267位碱基分别为G/T/T/A（用于鉴别欧益母草）、第245/247/250/253/256/263/267位碱基分别为A/A/A/C/G/G/A（用于鉴别细叶益母草）；其中，InDel位点为5
’
端第265位碱基T或A的缺失（用于鉴别细叶益母草），第266位碱基的缺失（用于三种益母草的鉴别）。2.鉴定3种益母草属植物的引物，其特征在于，所述3种益母草属植物包括益母草、欧益母草和细叶益母草；引物组1用于扩增含分子标记1的序列，包括：上游引物： 5
’‑ꢀ
CACACGTCGTAAAATTGAATCACAC
‑3’
，SEQ ID NO：3；下游引物： 5
’‑
GCTTAGCGCAAAGCAATGTATGC
ꢀ‑3’
，SEQ ID NO：4；引物组2用于扩增含分子标记2的序列，包括：上游引物： 5
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CAGATATGGATTTTACCGATCAG
‑3’
，SEQ ID NO...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜清，刘昶，张畅，王立强，
申请(专利权)人：清新天正北京国际科技有限责任公司青海民族大学，
类型：发明
国别省市：
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