猫ω干扰素、其编码基因及其表达和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种猫ω干扰素、其编码基因及其表达和应用，本发明专利技术根据已公布的猫源fIFNω2蛋白的氨基酸序列，经过序列设计，筛选出如SEQ ID NO.1所示的重组蛋白，经过鉴定本申请所提出的SUMO融合标签表达纯化的fIFNω2重组蛋白具有优秀的特异性和较高的体外抗病毒活性，同时其在大肠杆菌中的表达量较高。提出的编码基因能够实现在大肠杆菌中高效表达，并提高重组蛋白的制备效率。利用上述制备表达方法可获得纯度较高、活性较好的重组蛋白，制备方法具有工艺简单、成本低廉、蛋白纯度高、易于放大生产的特点，利于工业生产和大规模的推广应用。用。

【技术实现步骤摘要】
猫
ω
干扰素、其编码基因及其表达和应用


[0001]本专利技术涉及兽药
，特别涉及一种猫ω干扰素、其编码基因及其表达和应用。

技术介绍

[0002]干扰素(interferon，IFN)是由机体免疫细胞产生的一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性的糖蛋白。根据干扰素的来源、生物学性质及活性，将干扰素分Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型干扰素主要起抗病毒和抗肿瘤作用，包括IFN
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α、IFN
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β、IFN
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ω、IFN
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ε、IFN
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κ、IFN
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τ、IFN
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δ和IFN
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ζ等，Ⅱ型干扰素仅有IFN
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γ亚型，由抗原刺激细胞产生后在抗胞内病原体的宿主防御中起关键作用。
[0003]1992年，日本东丽株式会社的Nakamura等首次分离到了猫干扰素基因，将其归类为ω型干扰素，有研究表明IFN
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ω对于猫白血病毒(FLV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)共感染的猫以及细小病毒具有明显治疗效果，基于文献报道，猫ω干扰素共有13个亚型，其中活性较高的亚型是2和9。
[0004]IFN
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ω和IFN
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α的蛋白序列具有类似的结构特征，以IFN
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ω2(NM_001102440.1)为例，1
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23位氨基酸为信号肽序列，成熟蛋白的首位氨基酸为半胱氨酸(Cysteine)。而大肠杆菌表达体系，均以甲硫氨酸(Met)起始，为了获得活性序列和活性更接近天然蛋白的干扰素，必须以融合表达的方式进行。世界上首个获批的猫ω干扰素(IFN
‑
ω)VIRBAGEN OMEGA(生产公司相关信息)是以杆状病毒/家蚕表达体系表达并广泛用于犬和猫的细小病毒等的感染的辅助治疗。
[0005]近年来随着宠物行业的发展，猫作为传统伴侣动物，其健康越来越受关注，猫瘟、猫鼻支及猫杯状等疾病作为传染性疾病的预防和治疗主要依赖于疫苗的治疗。而现有技术中的猫ω干扰素存在着表达量不高、活性低等缺陷，且猫ω干扰素的外源表达主要包括在大肠杆菌表达系统中的表达，但现有技术中的这种表达方式存在着产量小、制备效率低下等缺陷，难以实现工业化生产。

技术实现思路

[0006]鉴于现有技术中存在的上述问题，本申请提出了一种猫ω干扰素、其编码基因及其表达和应用。
[0007]专利技术采用的技术方案是：提出了一种猫ω干扰素，其氨基酸序列SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术根据Unipro(www.uniprot.org)公布的猫源fIFNω2蛋白的氨基酸序列(Unipro编号：NM_001102440.1)，经过序列设计，筛选出如SEQ ID NO.1所示的重组蛋白(SUMO
‑
fIFNω2重组蛋白)，经过鉴定本申请所提出的SUMO
‑
fIFNω2重组蛋白具有优秀的特异性，本专利技术提供的fIFNω2重组蛋白具有较高的体外抗病毒活性，同时其在大肠杆菌中的表达量较高。
[0009]一种猫ω干扰素基因，其特征在于，编码如权利要求1所述的猫ω干扰素，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术提供的SUMO
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fIFNω2重组蛋白的编码基因能够实现在大肠杆菌中高效表达，并提高重组蛋白的制备效率。
[0011]一种包含所述的猫ω干扰素基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料是表达盒、载体或宿主细胞。
[0012]在一个较好的实施例中，载体为大肠杆菌表达载体，所述载体的制作方法如下：用NcoI及XhoI对大肠杆菌表达载体进行双酶切，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的猫ω干扰素的编码基因插入到表达载体，得到猫ω干扰素的载体。
[0013]一种表达猫ω干扰素的方法，包括步骤：(1)用权利要求4或5所述的载体转化大肠杆菌细胞，得到重组表达菌株；(2)重组表达菌株进行发酵，诱导猫ω干扰素的表达；以及(3)发酵结束后，回收并纯化所表达的猫ω干扰素。
[0014]猫ω干扰素的回收工艺包括：收集大肠杆菌菌体，经破碎收集包涵体，按照包涵体:变性缓冲液＝1:10(m:v)的比例溶解，得到变性样品溶液，按照变性缓冲液：复性缓冲液＝1:10(v:v)的比例再将变性样品溶液加入复性缓冲液得到复性样品溶液；所述变性缓冲液包括5
‑
50mM的Tris
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HCl，5
‑
8.5M的Urea，5
‑
50mM的DTT，且所述变性缓冲液的pH为8.0
‑
9.5；所述复性缓冲液包括5
‑
50mM的Tris
‑
HCl，0.5
‑
2.5M的Urea，1
‑
10mM的GSH及1
‑
10mM的GSSG，且所述复性缓冲液的pH为8.0
‑
9.5。
[0015]所述猫ω干扰素的纯化工艺包括：
[0016]步骤1、对复性样品溶液采用金属离子螯合亲和纯化并获得可溶和正确折叠蛋白；
[0017]步骤2、将步骤1中获得的蛋白进行酶切消化；
[0018]步骤3、将步骤2中得到的蛋白采用包括金属离子螯合纯化穿透、阴离子交换层析、凝胶层析中的至少一种方式进行纯化，得到猫ω干扰素。
[0019]所述步骤2中酶切方式为以下任意一种：
[0020]方法一，工具酶为肠激酶，酶切缓冲液包括5
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50mM的Tris
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HCl、50
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250mM的NaCl、1
‑
10mM的CaCl2，pH为7.0
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9.0，酶切比例为肠激酶:蛋白＝1:500
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1:2000(m:m)，4℃酶切10
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20小时；
[0021]方法二，工具酶为SUMO酶，酶切缓冲液包括5
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50mM的Tris
‑
HCl、1
‑
4M的Urea，pH为7.0
‑
9.0，酶切比例为SUMO酶:蛋白＝1:100
‑
1:500(m:m)，4℃酶切10
‑
20小时。
[0022]利用上述fIFNω2重组蛋白的制备方法可获得纯度较高、活性较好的fIFNω2重组蛋白，制备方法具有工艺简单、成本低廉、蛋白纯度高、易于放大生产的特点，利于工业生产和大规模的推广应用。
[0023]猫ω干扰素在制备猫FPV病毒的抗感染药物中的应用。
[0024]如上述的应用，所述猫ω干扰素保存于稳定剂中，所述稳定剂包括：5
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50mM的柠檬酸
‑
柠檬酸钠缓冲液，2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫ω干扰素，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种猫ω干扰素基因，其特征在于，编码如权利要求1所述的猫ω干扰素。3.根据权利要求2所述的猫ω干扰素基因，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种包含如权利要求2或3所述的猫ω干扰素基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料是表达盒、载体或宿主细胞。5.如权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述载体为大肠杆菌表达载体，所述载体的制作方法如下：用NcoI及XhoI对大肠杆菌表达载体进行双酶切，将氨基酸序列SEQ ID NO.1所示的猫ω干扰素的编码基因插入到表达载体，得到猫ω干扰素的载体。6.一种表达猫ω干扰素的方法，其特征在于，包括步骤：(1)用权利要求4或5所述的载体转化大肠杆菌细胞，得到重组表达菌株；(2)重组表达菌株进行发酵，诱导猫ω干扰素的表达；以及(3)发酵结束后，回收并纯化所表达的猫ω干扰素。7.根据权利要求6所述的表达猫ω干扰素的方法，其特征在于，猫ω干扰素的回收工艺包括：收集大肠杆菌菌体，经破碎收集包涵体，按照包涵体:变性缓冲液＝1:10(m:v)的比例溶解，得到变性样品溶液，按照变性缓冲液：复性缓冲液＝1:10(v:v)的比例再将变性样品溶液加入复性缓冲液得到复性样品溶液；所述变性缓冲液包括5
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50mM的Tris
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HCl，5
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8.5M的Urea，5
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50mM的DTT，且所述变性缓冲液的pH为8.0
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9.5；所述复性缓冲液包括5
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50mM的Tris
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HCl，0.5
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2.5M的Urea，1
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10mM的GSH及1
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10mM的GSSG，且所述复性缓冲液的pH为8.0
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9.5。8.根据权利要求6或...

【专利技术属性】
技术研发人员：马彦，赵明治，刘志龙，狄国栋，樊杰，其力格尔，朱旭，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：