一种基于可逆化学酶促标记的O-GlcNAc糖肽富集方法技术

本发明专利技术公开了一种基于可逆化学酶促标记

【技术实现步骤摘要】
一种基于可逆化学酶促标记的O
‑
GlcNAc糖肽富集方法


[0001]本专利技术属于蛋白质组学研究方向糖基化蛋白质翻译后修饰研究领域，具体涉及O
‑
GlcNAc糖链的新型化学酶促标记、富集和化学酶切等，实现了O
‑
GlcNAc糖肽的无质量标签的高效富集和高灵敏度检测。

技术介绍

[0002]蛋白质O
‑
GlcNAc修饰是一种普遍存在于真核细胞中的重要翻译后修饰，调节基因表达、信号转导、免疫应答、能量代谢等生理过程，与磷酸化修饰存在广泛的交互作用。蛋白质O
‑
GlcNAc修饰的异常与癌症发生、糖尿病、心血管病、神经退行性病变等重大疾病紧密相关。因此，深入研究蛋白质O
‑
GlcNAc修饰对于疾病的早诊和预防具有至关重要的意义。
[0003]高效液相色谱
‑
质谱联用技术是蛋白质O
‑
GlcNAc修饰大规模分析的最有效手段，但复杂生物样品种O
‑
GlcNAc修饰的蛋白质或肽段的丰度极低，并且其离子信号强度不仅被非糖基化的肽段抑制，受到N
‑
连接糖链和其他O
‑
糖链修饰碎片的干扰。因此，O
‑
GlcNAc蛋白质/肽段的高选择性富集成为其高覆盖度分析的关键。
[0004]目前主要有3类方法用于富集O
‑
GlcNAc糖肽或糖蛋白，包括凝集素亲和色谱法(文献1.Trinidad,J.C.et al.,Mol.Cell.Proteomics,2012,11,215
‑
229；文献2.Xu,S
‑
L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2017,11,215
‑
229)，酰肼化学法(文献3.Klement,E.et al.,J.Proteome Res.,2010,9,2200
‑
2206)，以及点击化学连接功能基团(文献4.Parker,B.et al.,J.Proteome Res.,2011,10,1449
‑
1458；文献5.Tsumoto,H.et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2015,25,2645
‑
2649)。亲水作用色谱法的原理是利用糖基化修饰对蛋白质或肽段亲水性的提升效应，该方法特异性较高，操作简便并能保持糖基结构的完整性，被广泛应用于N
‑
糖肽和糖蛋白的分离富集(文献6.Chen R.et al.J.Proteomics,2014,103,194
‑
203)，也被用于O
‑
GlcNAc糖肽的富集(文献8.Shen,B.et al.,Talanta 2017,169,195
‑
202)。然而，与N
‑
连接糖链和其他O
‑
连接糖链修饰相比，由单个糖基构成的O
‑
GlcNAc修饰对蛋白质或肽段的亲水性提升不够显著，从而限制了O
‑
GlcNAc糖肽亲水富集的选择性与效率。基于酰肼化学的方法，主要是针对O
‑
GlcNAc利用高碘酸钠氧化产生醛基，进而利用酰肼化学进行富集。然而，O
‑
GlcNAc糖型中的反式邻二醇羟基氧化困难，导致富集效率较低。目前，基于Cu(I)点击化学的酶促化学标记具有富集特异性高的优势，广泛应用于O
‑
GlcNAc的富集与分析。然而，其存在标记富集步骤繁琐、难以实现富集肽段的高效释放，并且存在富集糖肽质量标签大，导致肽段的鉴定灵敏度低的挑战。因此，发展针对新型化学酶促标记方法，提高糖肽的富集特异性与鉴定效率成为O
‑
GlcNAc糖基化分析的关键。
[0005]前期报道来自冻土毛霉(Mucor hiemalis)的糖苷内切酶Endo
‑
M N175Q突变体基本丧失了水解活性，但能够将低聚糖链整体转移到N
‑
连接的单个GlcNAc糖基上(文献9.Katoh T.et al.J.Biol.Chem.,2016,291,23305
‑
23317.)。在本专利技术中，我们利用Endo
‑
M N175Q将带有噁唑啉反应基团的N
‑
糖链类似物整体转接到糖肽的O
‑
GlcNAc糖基上，利用亲水作用色谱实现标记糖肽的一步富集，简化富集步骤，提高糖肽的富集效率；在此基础上，
针对化学酶促标记引入质量标签的问题，利用野生型Endo
‑
M酶将标记的糖可逆去除，进而实现了O
‑
GlcNAc糖肽的无痕富集，提高了其质谱检测灵敏度与效率，进而有利于O
‑
GlcNAc糖基化的高效富集与分析。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种可以高效、高通量、高特异性分析复杂生物样品中O
‑
GlcNAc修饰蛋白质组信息的方法。本专利技术提供的方法是基于肽段上修饰的O
‑
GlcNAc基团可以被来自冻土毛霉的糖苷内切酶Endo
‑
MN175Q突变体转接上噁唑啉结构的糖链CT(组成为(Gal)2(GlcNAc)3(Man)3，相对分子质量为1419.5)，使其能与环氧叠氮麦芽糖亲水色谱材料发生紧密的非共价结合，从而将O
‑
GlcNAc糖肽从复杂样品中富集分离出来，再联用多种野生型的糖苷内切酶将转接的糖链切除，恢复肽段上的O
‑
GlcNAc基团，然后通过质谱分析得到样品的O
‑
GlcNAc糖蛋白质组信息。该方法可以总的表述为，基于糖链的整体转移与切除的亲水作用色谱法用于高通量分析样品中的O
‑
GlcNAc糖蛋白质组信息。
[0007]本专利技术采用如下技术方案：
[0008]首先，提取细胞和/或组织的蛋白样品，用胰蛋白酶Trypsin酶解，再用糖苷酶PNGase F处理，然后用来自冻土毛霉的糖苷内切酶突变体Endo
‑
MN175Q将噁唑啉结构的糖链CT(组成为(Gal)2(GlcNAc)3(Man)3，相对分子质量为1419.5)转接到肽段的O
‑
GlcNAc糖基上，利用麦芽糖亲水色谱材料富集标记的O
‑
GlcNAc肽段，再联用来自冻土毛霉的野生型糖苷内切酶Endo
‑
M WT和来自酿脓链球菌的野生型糖苷内切酶Endo
‑
S WT，切除CT糖链而保留原位O
‑
GlcNAc糖基，以用于O
‑
GlcNAc糖基化位点、O
‑
GlcNAc糖肽以及对应的糖蛋白信息的鉴定。
[0009]具体包含以下步骤：
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种O
‑
GlcNAc糖肽可逆化学酶促标记与富集方法，其特征在于：该方法利用糖苷内切酶Endo
‑
M的N175Q突变体向O
‑
GlcNAc糖基上转移寡糖链以提升亲水性，进而利用麦芽糖亲水作用色谱材料进行O
‑
GlcNAc延长糖肽的富集；针对富集的糖链，利用野生型的糖苷内切酶Endo
‑
M WT和Endo
‑
S WT进行标记糖链的切除，获得生物样品中的O
‑
GlcNAc糖肽。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)O
‑
GlcNAc糖肽的化学酶促标记，具体操作为：以噁唑啉结构的糖链CT(组成为(Gal)2(GlcNAc)3(Man)3，终浓度为8～10mM，相对分子质量为1419.5，制备方法参见Huang W.et al.,2009,J.Am.Chem.Soc.p.2222)作为标记试剂，以终浓度为0.4～0.5μg/μl的糖苷内切酶Endo
‑
M的N175Q突变体(制备方法参见Umekawa M.et al.,2010,J.Biol.Chem.pp.512
–
513)于36～38℃下在pH 7.1～7.3的180～220mM磷酸钠缓冲液中向生物肽段样品中的O
‑
GlcNAc基团催化标记糖链；(2)O
‑
GlcNAc标记糖肽的富集，基于延长O
‑
GlcNAc糖肽的亲水性强的特征，在室温下的78～82％乙腈(ACN)/0.9～1.1％三氟乙酸(TFA)体系中利用环氧叠氮麦芽糖亲水作用色谱材料(制备方法参见Yu L.et al.,2009,Chem.Eur.J.pp.12618
–
12626)的非共价键作用实现对O
‑
GlcNAc标记糖肽的选择性富集；(3)O
‑
GlcNAc糖肽的糖链切除，基于糖苷内切酶的酶切活性与特异性，于36～38℃下在pH 6.3～6.5的45～55mM磷酸钠缓冲液中利用野生型的糖苷内切酶Endo
‑
M WT(终浓度为0.18～0.22μg/μl，制备方法参见Umekawa M.et al.,2010,J.Biol.Chem.pp.512
–
513)和Endo
‑
S WT(终浓度为0.45～0.55μg/μl，制备方法参见Huang W.et al.,2012,J.Am.Chem.Soc.p.12316)进行标记糖链的切除，以恢复O
‑
GlcNAc糖基的结构。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生物样品是指进行动物、植物、或微生物中的一种或二种以上的组织和/或细胞等生物肽段样品；生物肽段样品的获取过程为：提取细胞或组织的蛋白样品，用胰蛋白酶Trypsin酶解，再用糖苷酶PNGase F处理，获得生物肽段样品。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：进行组织、细胞等生物样品中O
‑
GlcNAc糖肽的富集；基于糖苷内切酶突变体辅助的O
‑
GlcNAc糖肽可逆化学酶促标记与富集方法，将其应用于生物样品O
‑
GlcNAc糖基化的分析与检测，进而可获得O
‑
GlcNAc修饰糖蛋白、糖肽和糖基化位点的鉴定结果，可用于肿瘤代谢等疾病中关键蛋白糖基化的调控机制研究。5.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，具体包含以下步骤：1)取生物样品，提取生物蛋白质样品，加入终浓度为9～11mM的二硫苏糖醇(DTT)，36～38℃水浴110～130min，冷却到20～25℃后加入终浓度为18～22mM的碘乙酰胺(IAM)，避光反应30～35min，混匀；2)将步骤1)得到的蛋白质变性样品每0.2mg加入1个10KDa超滤膜中，20～25℃以14000
×
g离心，向超滤膜中加入0.09～0.11ml含7.8～8.2M尿素和90～110mM碳酸氢铵的水溶液，20～25℃以14000
×
g离心，弃滤出液；超滤膜中再加入0.09～0.11ml含90～110mM碳酸氢铵的水溶液洗涤，20～25℃以14000
×
g离心，重复1～2次洗涤过程，弃滤出液；3)向步骤2)的超滤膜中加入0.18～0.22ml含18～22mM碳酸氢铵的水溶液和18～22μl含9～11μg胰蛋白酶的水溶液，置于36～38℃摇床内酶切15～17h后，20～25℃以14000
×
g
离心，超滤膜中再加入45～55μl含18～22mM碳酸氢铵的水溶液洗涤，20～25℃以14000
×
g离心，重复1～2次洗涤过程，向滤出液中加入与肽段质量比为0.9～1.1单位/μg的PNGase F，置于36～38℃摇床内酶切15～17h后加入终浓度为0.9～1.1％的三氟乙酸(TFA)，混匀后用C18固相萃取柱除去其他小分子，将收集的0.9～1.1ml洗脱液成分为78～82％乙腈(ACN)/0.09～0.11％甲酸(FA)水溶液(v/v)的肽段洗脱液冷冻干燥为0.2mg/份；4)使用180～220mM磷酸钠缓冲液(pH 7.1～7.3)溶解步骤3)得到的1份干燥肽段，20～25℃以14000
×
g离心，取上清液加入终浓度为8～10mM的CT
‑
ox混匀，再加入终浓度为0.45μg/μl的Endo
‑
M N175Q混匀，使肽段终浓度为6.5～7.5μg/μl，置于36～38℃摇床内反应110～130min，反应完毕后加入终浓度为0.9～1.1％的TFA混匀，加入C18固相萃取柱除去其他小分子，将得到的0.45～0.55ml肽段洗脱液(78～82％ACN/0.09～0.11％FA水溶液，v/v)冷冻干燥后用180～220μl 78～82％ACN/0.9～1.1％TFA水溶液(v/v)溶解，20～25℃以20000
×
g离心，取上清液加入洗净的4.5～5.5mg环氧叠氮麦芽糖亲水色谱材料，20～25℃，1100～1300rpm振荡50～70min后加入1mm厚C18材料(材料粒径5μm，膜孔径1.5μm)膜上截留，去除滤出液后使用140～160μl 78～82％ACN/0.9～1.1％TFA水溶液(v/v)洗涤材料，弃滤出液，重复2次，最后向材料加入230～270μl的28～32％ACN/0.9～...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶明亮，秦洪强，陈尧，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：