一种发酵生产土霉素的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产土霉素的方法，属于微生物发酵技术领域。该方法包括以下步骤：将土霉素的生产菌株于斜面培养基上培养至成熟，将孢子制成孢子悬液，将孢子悬液与新鲜的大肠杆菌菌悬液混匀，孢子与大肠杆菌的数量比为1：0.5

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产土霉素的方法


[0001]本专利技术涉及一种生产抗生素的方法，具体涉及一种发酵生产土霉素的方法，属于微生物发酵


技术介绍

[0002]土霉素（Oxytetracycline，OTC）又称氧四环素，属于四环素类广谱抗生素，主要抗菌机制是特异性地与细菌核糖体30S亚基A位结合，阻止氨酰tRNA核糖体复合体的形成，抑制蛋白质多肽链的延长，对革兰氏阳性菌、阴性菌、支原体、衣原体、立克次氏体等引起的感染均有很好疗效，在畜牧业、水产养殖业以及其它领域均具有广泛的应用。
[0003]在土霉素发酵过程中，会形成多种杂质，例如：4
‑
差向土霉素（4
‑
epi
‑
oxytetracycline，EOTC）、2
‑
乙酰
‑2‑
去酰胺土霉素（2
‑
acetyl
‑2‑
decarboxamido
‑
oxytetracycline，ADOTC，俗称拖尾峰）、四环素（tetracycline，TC）、4
‑
差向四环素（4
‑
epi
‑
tetracycline，ETC）等，其中，ADOTC和TC对成品质量影响较大。
[0004]据文献报道，ADOTC与OTC的区别在于2位上的
‑
CH3被
‑
NH2取代，ADOTC与OTC的合成主要受OxyD和OxyP的影响（Wang P，Gao X，Chooi YH，Deng Z，Tang Y，Genetic characterization of enzymes involved in the priming steps of oxytetracycline biosynthesis in Streptomyces rimosus，Microbiology（Reading），2011 Aug，157（Pt 8）：2401
‑
2409。）。TC与OTC的区别在于5位上的
‑
H被
‑
OH取代，TC与OTC的合成主要受OxyS和OxyR的影响（Wang P，Bashiri G，Gao X，Sawaya MR，Tang Y，Uncovering the enzymes that catalyze the final steps in oxytetracycline biosynthesis，J Am Chem Soc，2013 May 15，135（19）：7138
‑
41。）。
[0005]在合成机理清晰的情况下，可以通过基因工程手段对土霉素的生产菌株进行改造，然而，传统的微生物育种方法和发酵工艺优化仍然是发酵工业不可或缺的手段。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种既可以提高土霉素发酵水平，又可以降低杂质（例如：ADOTC、TC）含量的发酵生产土霉素的方法。
[0007]为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种发酵生产土霉素的方法，包括以下步骤：Step1：将土霉素的生产菌株龟裂链霉菌于斜面培养基上培养至成熟，然后将孢子刮下并用无菌水制成孢子悬液；Step2：将孢子悬液与新鲜的大肠杆菌菌悬液混匀，孢子与大肠杆菌的数量比为1：0.5
‑
1，然后将混合菌液涂布于平板培养基上，于37℃培养12h；Step3：向平板培养基上涂布萘啶酮酸，萘啶酮酸的终浓度为30
‑
50μg/mL，之后于37℃继续培养5d；Step4：将孢子转接到斜面培养基上，先于37℃培养3d，再于30℃培养1d；
Step5：将孢子刮下并接种至种子培养基中，在30℃、220rpm的条件下震荡培养22h；Step6：按照5%的接种量将种液接种到发酵培养基中，在30℃、250rpm的条件下震荡培养5d。
[0008]优选的，在Step1和Step4中，以质量百分比计，所述斜面培养基的组成为：麸皮7.0%，琼脂2.2%，自来水配制，pH自然。
[0009]优选的，在Step2中，以质量百分比计，所述平板培养基的组成为：淀粉3.0%，碳酸钙0.3%，硫酸铵0.4%，氯化钠0.5%，玉米浆1.0%，琼脂2.2%，自来水配制，pH自然。
[0010]优选的，在Step5中，以质量百分比计，所述种子培养基的组成为：淀粉2.5%，黄豆饼粉0.25%，碳酸钙0.5%，硫酸铵0.4%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.01%，谷氨酰胺0.05%，玉米浆1.0%，自来水配制，pH自然。
[0011]优选的，在Step6中，以质量百分比计，所述发酵培养基的组成为：淀粉12.0%，黄豆饼粉2.0%，碳酸钙1.5%，硫酸铵1.0%，氯化钠0.4%，磷酸二氢钾0.005%，谷氨酰胺0.05%，氨水0.05%，氯化钴0.001%，玉米浆1.0%，消沫剂0.01%，淀粉酶0.012%，自来水配制，pH自然。
[0012]本专利技术的有益之处在于：（1）本专利技术突破了人们依赖经验的思想，从土霉素生物合成的机理及抗生素合成需要的条件和时机出发，模拟了菌体产生抗生素的环境，触发了菌体产生更多抗菌物质，结合发酵工艺优化，提高了土霉素发酵水平，并降低了ADOTC、TC等杂质的含量。
[0013]（2）本专利技术提供的发酵方法操作简单，容易实施，适宜工业化生产。
实施方式
[0014]以下结合具体实施例对本专利技术作具体的介绍。
[0015]实施例1土霉素的生产菌株：龟裂链霉菌M4018（S.rimosus M4018）、龟裂链霉菌ATCC 10970（S.rimosus ATCC 10970）。
[0016]斜面培养基（以质量百分比计）：麸皮7.0%，琼脂2.2%，自来水配制，pH自然。
[0017]种子培养基（以质量百分比计）：淀粉3.0%，黄豆饼粉0.3%，碳酸钙0.5%，硫酸铵0.4%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.015%，玉米浆1.0%，自来水配制，pH自然。
[0018]发酵培养基（以质量百分比计）：淀粉12.0%，黄豆饼粉2.0%，碳酸钙1.5%，硫酸铵1.5%，氯化钠0.4%，磷酸二氢钾0.01%，氯化钴0.001%，玉米浆1.0%，消沫剂0.01%，淀粉酶0.012%，自来水配制，pH自然。
[0019]取S.rimosus M4018和S.rimosus ATCC 10970砂土管，在无菌条件下将S.rimosus M4018和S.rimosus ATCC 10970分别接种于斜面培养基上，先于37℃培养3d，再于30℃培养1d，斜面成熟后将孢子刮下并接种至种子培养基中，在30℃、220rpm的条件下震荡培养24h，种液成熟后按照5%的接种量接种到发酵培养基中，在30℃、220rpm的条件下震荡培养7d（发酵结束）。
[0020]发酵结束后，取5mL发酵液，向其中加入浓度为9mol/L的盐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产土霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：将土霉素的生产菌株龟裂链霉菌于斜面培养基上培养至成熟，然后将孢子刮下并用无菌水制成孢子悬液；Step2：将孢子悬液与新鲜的大肠杆菌菌悬液混匀，孢子与大肠杆菌的数量比为1：0.5
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1，然后将混合菌液涂布于平板培养基上，于37℃培养12h；Step3：向平板培养基上涂布萘啶酮酸，萘啶酮酸的终浓度为30
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50μg/mL，之后于37℃继续培养5d；Step4：将孢子转接到斜面培养基上，先于37℃培养3d，再于30℃培养1d；Step5：将孢子刮下并接种至种子培养基中，在30℃、220rpm的条件下震荡培养22h；Step6：按照5%的接种量将种液接种到发酵培养基中，在30℃、250rpm的条件下震荡培养5d。2.根据权利要求1所述的发酵生产土霉素的方法，其特征在于，在Step1和Step4中，以质量百分比计，所述斜面培养基的组成为：麸皮7.0%，琼脂2.2%，自...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雪峰，陈力，耿海波，张丽媛，杨萌，
申请(专利权)人：石家庄职业技术学院石家庄开放大学，
类型：发明
国别省市：