一种鸡艾美尔球虫重组基因TEIN蛋白及医用用途制造技术

本发明专利技术公开了一种鸡艾美尔球虫重组基因TEIN蛋白及医用用途，提供了一种新的鸡球虫重组TEIN蛋白，该重组基因TEIN蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达量可达0.7mg/mL；可以用于柔嫩艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、堆型艾美尔球虫和巨型艾美尔球虫四种球虫单独和混合感染的预防；其中抗柔嫩艾美尔球虫指数达174.82、抗毒害艾美尔球虫指数达180.61、抗堆型艾美尔球虫指数达174.58、抗巨型艾美尔球虫指数达174.41、抗混合感染艾美尔球虫指数达175.95；可以用于制备治疗鸡球虫病的药物和疫苗。可以用于制备治疗鸡球虫病的药物和疫苗。可以用于制备治疗鸡球虫病的药物和疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡艾美尔球虫重组基因TEIN蛋白及医用用途


[0001]本专利技术公开一种鸡艾美尔球虫重组基因TEIN蛋白及制备方法，由柔嫩艾美尔球虫TA4基因、堆型艾美尔球虫3
‑
1E基因、巨型艾美尔球虫IMP1基因和毒害艾美尔球虫NA4基因等4个基因由GS Linker连接而成的新的基因，命名为TEIN蛋白，可用于鸡球虫病的预防，同时提供了该重组基因蛋白的制备方法，属于基因工程


技术介绍

[0002]鸡球虫病是由艾美耳球虫等引起的一种常见多发原虫病。鸡感染球虫后，肠道会受到严重损害，甚至引起死亡，对养鸡业危害巨大。目前报道的鸡球虫病原体主要有9种，以柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)、毒害艾美尔球虫（E.necatrix)、堆型艾美耳球虫(E.acerulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、早熟艾美尔球虫(E.praecox)以及和缓艾美尔球虫(E.mitis)7种为主。其中临床上以柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫较常见，且多为混合感染。鸡球虫病的传统防控措施主要有药物防治和疫苗预防。随着时间的推移，鸡球虫耐药虫株的产生和药物残留问题加大了鸡球虫病防治难度。活疫苗的使用存在毒力返祖和散毒等问题，因此亟需研制一种安全稳定的新型疫苗。运用现代生物技术构建的基因工程疫苗具有安全性高、成本低廉等优点，已逐渐受到广泛关注。目前基因工程亚单位疫苗多采用大肠杆菌原核表达系统进行抗原的表达，毕赤酵母表达系统具有基因操作简单、发酵生长速度快、外源基因蛋白表达量高、成本低廉等优点。目前尚无鸡球虫重组基因TEIN以及利用毕赤酵母表达系统表达的相关报导。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供了一种鸡艾美尔球虫重组基因TEIN蛋白，是一种新的重组基因TEIN蛋白，可以用于制备治疗鸡球虫病的药物和疫苗；本专利技术还进一步公开了其制备方法及医用用途。
[0004]本专利技术所说的一种鸡艾美尔球虫重组基因TEIN蛋白，基因序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术所说的一种鸡艾美尔球虫重组基因TEIN蛋白的制备方法，技术解决方案如下：选择柔嫩艾美尔球虫TA4基因、堆型艾美尔球虫3
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1E基因、巨型艾美尔球虫IMP1基因和毒害艾美尔球虫NA4基因通过GS Linker进行串联而得，命名为TEIN，并构建毕赤酵母表达载体pPIC9K
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TA4
‑3‑
1E
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IMP1
‑
NA4（命名为pPIC9K
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TEIN）和大肠杆菌表达载体pET32a
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TEIN（用于和毕赤酵母表达载体作对照），将构建的重组质粒经双酶切鉴定，测序正确后进行诱导表达，利用SDS
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PAGE和Western
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blot进行分析鉴定，大量表达及纯化后分别与氢氧化铝胶佐剂按照1：1混合均匀制成鸡球虫重组基因TEIN蛋白，对其免疫保护效果进行评价。
[0005]TEIN基因特征在于它是由柔嫩艾美尔球虫TA4基因、堆型艾美尔球虫3
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1E基因、巨型艾美尔球虫IMP1基因和毒害艾美尔球虫NA4基因通过GS Linker串联得到，基因大小约为2900bp。其TEIN蛋白是由毕赤酵母表达系统表达获得，其蛋白大小为110kDa。
[0006]本专利技术的目的可通过如下技术方案实现:
[0007]提取E. tenella(Et)、E. necatrix(En)、E.acerulina(Ea)和E. maxima(Em)四种球虫孢子化卵囊总RNA，反转录合成cDNA第一链，以此为模板克隆EtTA4、EnNA4、Ea3
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1E、EmIMP1目的基因，将四个基因通过GS Linker进行串联，串联后的基因命名为TEIN。
[0008]将PCR产物分别与表达载体pPIC9K和pET32a在T4 DNA连接酶作用下连接过夜，转化至感受态细胞DH5α中，挑取阳性克隆进行双酶切鉴定，鉴定成功后进行测序，构建重组表达载体pPIC9K
‑
TEIN和pET32a
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TEIN。
[0009]将pET32a
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TEIN质粒转化至感受态细胞BL21（DE23）后经IPTG进行诱导表达，表达产物经SDS
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PAGE和Western
‑
blot鉴定。
[0010]同时将pPIC9K
‑
TEIN重组载体质粒线性化，电转至酵母感受态细胞GS115，通过对阳性转化子进行筛选鉴定，G418筛选高表达菌株后利用BMGY和BMMY培养基进行诱导表达，并对表达产物进行SDS
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PAGE和Westernblot分析鉴定。获得鸡艾美尔球虫重组基因TEIN蛋白。
[0011]鸡艾美尔球虫重组基因TEIN蛋白纯化产物分别与氢氧化铝胶佐剂按1:1混合制备成免疫用鸡球虫重组TEIN蛋白。
[0012]2、鸡球虫重组TEIN蛋白免疫保护效果评价将1日龄雏鸡随机分组，每组20只。各组攻虫时，每种球虫分别设立非免疫攻虫组（红对照组）和共用的非免疫非攻虫组（白对照组）。将纯化好的pPIC9K
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TEIN和pET32a
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TEIN重组蛋白样品分别与氢氧化铝佐剂按1：1比例进行混合后使用。于14日龄按照100 μg/羽剂量经腿部肌肉注射，21日龄按相同剂量加强免疫，28日龄除非免疫非攻虫组外，其余各组按1
×
104个/羽分别口服新鲜的E.tenella、E.necatrix、E.acervulina、E.maxima和四种球虫混合的孢子化卵囊。35日龄（攻虫后7天）时每组随机取5只雏鸡剖杀，逐只进行肠道病变记分和卵囊计数。各组于首免、攻虫和剖杀时逐只称重，最后通过计算抗球虫指数ACI来综合评价重组蛋白的免疫保护效果。以ACI=（存活率+相对增重率）
‑
（病变值+卵囊值）计算公式来判定。ACI≧180为保护效果明显，ACI=160~179为保护效果一般，ACI<160为无保护效果。
[0013]本专利技术的积极效果在于：提供了一种新的鸡球虫重组TEIN蛋白，该重组基因TEIN蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达量可达0.7mg/mL；可以用于柔嫩艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、堆型艾美尔球虫和巨型艾美尔球虫四种球虫单独和混合感染的预防；其中抗柔嫩艾美尔球虫指数达174.82、抗毒害艾美尔球虫指数达180.61、抗堆型艾美尔球虫指数达174.58、抗巨型艾美尔球虫指数达174.41、抗混合感染艾美尔球虫指数达175.95；可以用于制备治疗鸡球虫病的药物和疫苗。
附图说明
[0014]图1为本专利技术扩增的EtTA4、EnNA4、Ea3
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1E、EmIMP1基因（M：DL2000Marker；1：EtT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡艾美尔球虫重组基因TEIN蛋白，其特征在于：基因序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的一种鸡艾美尔球虫重组基因TEIN蛋白的制备方法，包括以下步骤：提取E. tenella、E. necatrix、E.acerulina和 E. maxima四种球虫孢子化卵囊总RNA，反转录合成cDNA第一链，以此为模板克隆EtTA4、EnNA4、Ea3
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1E、EmIMP1目的基因，将四个基因通过GS Linker进行串联；将PCR产物分别与表达载体pPIC9K和pET32a在T4 DNA连接酶作用下连接过夜，转化至感受态细胞DH5α中，挑取阳性克隆进行双酶切鉴定，鉴定成功后进行测序，构建重组表达载体pPIC9K
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TEIN和pET32a
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TEIN；将p...

【专利技术属性】
技术研发人员：张西臣，程淑琴，宫鹏涛，张楠，王晓岑，李建华，李新，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：