用于浓缩和鉴定血液中微生物的系统、方法和设备技术方案

披露了用于从已知含有或可能含有微生物的样品中分离和鉴定微生物的系统、方法和设备。备。备。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于浓缩和鉴定血液中微生物的系统、方法和设备
相关申请
[0001]本申请要求于2020年12月16日提交的美国临时专利申请号63/126,041的权益和优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。专利技术背景
1.

[0002]本披露的实施例总体上涉及用于直接从血液诊断脓毒症的系统、方法和设备。
2.
技术介绍

[0003]在美国、加拿大和西欧，传染病约占人类死亡率的7％；而在发展中地区，传染病占人类死亡率的40％以上。传染病会导致多种临床表现。常见的明显表现包括发烧、肺炎、脑膜炎、腹泻和带血腹泻。虽然身体表现可提示一些病原体并排除其他病原体作为病因，但仍然存在多种潜在的致病因子，并且明确的诊断通常需要进行多种测定。
[0004]在美国，血流感染(BSI)和由此产生的脓毒症休克(也称为脓毒症、败血症、菌血症、真菌血症、念珠菌病、念珠菌血症、血源性感染和其他相关术语)是导致死亡的主要原因。例如，细菌性BSI是成人死亡的第11大原因和婴儿死亡的第7大原因。念珠菌属物种和其他真菌也可引起BSI。念珠菌属物种的血流感染与高死亡率(40％)相关，这主要归因于血培养所需的诊断时间较长。研究表明，开始适当的抗细菌或抗真菌治疗可以降低死亡率，并且观察到每延迟一小时抗微生物施用，死亡率都会显著增加。因此，需要使用适当的抗生素或抗真菌剂进行早期检测和明确诊断以及快速治疗，以改善疑似BSI患者的结局。
[0005]目前BSI的诊断金标准要求生物在培养中生长，然后对纯化的分离物进行显微观察、继代培养和表型鉴定。这导致针对革兰氏阳性细菌的报告时间范围为36
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72小时、针对革兰氏阴性细菌为48
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96小时，而针对真菌感染为48
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120小时。令人担忧的是，大约三分之一接受真菌BSI治疗的患者从未表现出阳性血培养生长，并且许多真菌BSI阳性病例仅基于尸检分析得到明确诊断。因此，医生通常会在抽血培养后立即开始用广谱抗生素或抗真菌剂方案来治疗疑似患有BSI的患者。这并不理想。研究表明，施用不充分或无效的抗微生物治疗无助于改善患者结局，并且令人痛心的是发现其导致耐药生物的增加，这会独立地损害患者结局和整体公共卫生。
[0006]诊断金标准(即经典微生物学方法)的一种替代方案包括对血液中的传染性细菌和真菌进行分子鉴定。然而，在BSI的全血中发现的传染性生物的数量通常很少(约1
‑
100个菌落形成单位/毫升血液(cfu/ml)，并且在大多数经培养确认的脓毒症个体中，典型值为约1
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10cfu/ml)。此外，血液中含有多种聚合酶链式反应(PCR)抑制剂(例如，血红蛋白和其他血蛋白(例如人血清白蛋白)和来自白细胞的基因组DNA，它们可以与微生物共纯化并干扰核酸从靶微生物回收和下游PCR两者)。全血中的生物很少且存在PCR抑制剂，因此需要从更大体积的全血(例如，1
‑
20mL)中浓缩，以获得在临床相关微生物水平上实现灵敏度所需的质量和数量的DNA模板。
[0007]迫切需要更快速、更准确的基于分子的诊断，以减少未感染患者接受的无效或不必要的广谱抗微生物剂的剂量。快速诊断可以允许对确实患有BSI的患者及时施用更有针对性和更有效的抗微生物疗法。尽管存在这些许多潜在优势，但许多已经尝试过的快速BSI诊断解决方案并未得到广泛采用。这是出于多种原因，包括繁琐的工作流程、获得结果的时间、和成本。
[0008]上市的一种产品称为MolYsis
TM
，它有望从全血中的完整生物中选择性分离细菌DNA。MolYsis
TM
Complete5 DNA提取试剂盒(目录号D
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321
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100；德国不莱梅的莫尔齐姆公司(Molzym GmbH&Co.KG))包括用于选择性裂解血液因子(红细胞、白细胞等)的离散裂解缓冲液和用于降解基因组DNA的DNA酶。通过离心回收微生物细胞，弃去上清液，将细胞在不同的缓冲液中重悬并重复沉淀数次，对微生物细胞进行化学裂解，并且最后回收微生物核酸。总之，MolYsis
TM
试剂盒涉及繁琐的工作流程，需要约45分钟进行样品制备以及另外约45分钟进行微生物细胞清理和裂解。微生物的鉴定需要将用MolYsis
TM
试剂盒回收的核酸输入到另一测定中，这需要额外的时间和额外的费用。此外，成功使用MolYsis
TM
试剂盒需要熟练的技术人员。对操作员技能的依赖增加了操作员与操作员之间在结果产量和质量方面存在差异的风险。多种缓冲液和手动移液步骤增加了样品交叉污染的风险。
[0009]旨在用于从全血中鉴定BSI的另一产品是来自T2生物系统公司(T2 Biosystems)的系统包括自动化样品制备，其包括血液因子的选择性裂解、微生物回收、微生物裂解、微生物衍生核酸的回收、和PCR扩增。系统使用核磁共振(NMR)进行微生物鉴定。溶液中的超顺磁性NMR纳米探针与微生物特异性DNA结合并形成可被NMR检测到的团块。与来自未聚集的纳米探针的NMR信号相比，由于存在微生物核酸而聚集的纳米探针产生更大的信号。然而，系统需要4
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6小时的NMR数据收集，以便获得可用于微生物鉴定的足够质量的数据。系统还很昂贵(仪器成本为约150,000美元)，并且由于数据收集所需的时间，仪器的通量受到严重限制。此外，与BSI相关的细菌和真菌在单独的面板上进行测试。这意味着出现脓毒症症状的患者必须针对细菌和真菌面板进行测试，以便确认/排除细菌和真菌原因。此外，在细菌和真菌面板上测试的生物数量有限(每个会测试约六种生物)，并且这些测试没有提供有关药物敏感性/耐药性的信息。
[0010]本专利技术致力于与直接从血液中鉴定BSI相关微生物有关的各种改善，具有简化的工作流程和更快速的从样品到结果(sample
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to
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answer)。

技术实现思路

[0011]本专利技术提供了用于从样品中浓缩、表征和/或鉴定微生物的方法、系统和设备。在一个实施例中，微生物是细菌。在另一个实施例中，微生物是真菌生物(例如，酵母或霉菌)。在再一个实施例中，微生物是寄生虫。这些方法、系统和设备可能特别有用于从复杂样品(例如血液或尿液或脑脊液)中分离、浓缩、表征和/或鉴定微生物。在优选的方面，本专利技术的方法、系统和设备可用于直接从全血中浓缩、表征和/或鉴定微生物，以便快速确定患者是否患有脓毒症。在典型的脓毒症中，血流中的微生物浓度很低。例如，约<1
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100cfu/ml，而约<1
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10cfu/ml是典型值。在脓毒症患者或疑似脓毒症患者中，血液中的微生物(如果存在)太
稀而无法在不用本文所述的方法的情况下直接从血液样品中鉴定。此外，血液中含有多种PCR抑制剂(例如，血红蛋白、人血清白蛋白和基因组DNA)，可以适当地去除这些抑制剂，以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离和鉴定微生物的方法，所述方法包括：(a)提供一定体积的疑似含有所述微生物的血液样品；(b)将所述血液样品与差异裂解缓冲液混合以产生裂解物，其中所述裂解物包含裂解的血细胞和未裂解的微生物；(c)从所述裂解物中浓缩所述微生物；(d)将所述微生物添加到装置中，所述装置包括鉴定所述微生物所需的一种或多种试剂；和(e)鉴定所述血液样品中存在的所述微生物，其中如果存在所述微生物，则相对于提供的血液样品的体积，将所述微生物浓缩在25至100倍的范围内，并且其中如果存在所述微生物，则提供的血液样品中所述微生物的浓度在约<1CFU/ml至约20CFU/ml的范围内。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)
‑
(c)可以在约10至20分钟的时间范围内完成。3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)和(e)可以在小于4小时、优选小于3小时、优选小于2小时、或更优选小于1小时的时间范围内完成。4.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物是与血源性感染相关的细菌生物或真菌生物。5.如权利要求1所述的方法，其中所述鉴定包括分子测试、表型测试、蛋白质组测试、光学测试或基于培养的测试中的一项或多项。6.如权利要求1所述的方法，其中所述鉴定包括以下步骤：从所述微生物中分离具有所述微生物特征的一种或多种核酸，以及分析所述一种或多种核酸以鉴定所述血液样品中存在的所述微生物。7.如权利要求6所述的方法，其中所述鉴定进一步包括扩增一种或多种核酸，然后检测所述一种或多种扩增的核酸。8.如权利要求7所述的方法，其中所述检测所述一种或多种扩增的核酸包括使用dsDNA结合染料、实时PCR、扩增后核酸解链步骤、核酸测序步骤、标记的DNA结合探针或未标记的探针中的一种或多种。9.如权利要求6
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8中任一项所述的方法，其中鉴定步骤可以在约5至75分钟的时间范围内完成。10.如权利要求6
‑
8中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在培养基中对浓缩的微生物进行培养步骤以增加所述微生物的浓度，然后进行鉴定步骤，其中所述培养步骤进行4小时或更短时间、3小时或更短时间或2小时或更短时间，优选3小时或更短时间。11.如权利要求1所述的方法，其中所述差异裂解缓冲液包含缓冲物质、非离子表面活性剂、盐，并且在将所述血液样品与所述差异裂解缓冲液混合之前pH范围在约10
‑
11。12.如权利要求11所述的方法，其中在将所述血液样品与所述差异裂解缓冲液混合之后，所述差异裂解缓冲液具有约7.0至8.0的pH。13.如权利要求11所述的方法，其中所述缓冲物质选自由以下组成的组：CABS、CAPS、CAPS、CHES及其组合，并且其中所述缓冲物质优选为CAPS。
14.如权利要求11所述的方法，其中与所述血液样品混合的所述差异裂解缓冲液的pH比所述缓冲物质的pH缓冲范围低约1.5至2.5个pH单位。15.如权利要求11所述的方法，其中所述非离子表面活性剂是聚氧乙烯(POE)醚，优选Arlasolve 200(又名，聚(氧
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1,2
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乙二基))、Brij O10和九乙二醇单十二烷基醚(又名，Brij 35)中的一种或多种。16.如权利要求11所述的方法，其中所述非离子表面活性剂选自由以下组成的组：Triton X
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114、NP
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40、Arlasolve 200、Brij O10(又名，Brij 96/97)、辛基β
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D
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吡喃葡萄糖苷、皂苷、九乙二醇单十二烷基醚(又名，Brij 35)及其组合。17.如权利要求1所述的方法，其中从所述裂解物中浓缩所述微生物包括离心，并且所述浓缩进一步包括从包含裂解的血液部分的上清液部分回收包含所述微生物的沉淀部分。18.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：将与所述差异裂解缓冲液混合的所述血液样品置于离心浓缩器中，其中所述离心浓缩器包括：腔室，所述腔室在第一端具有开口并且在第二端具有密封部分，其中所述密封部分被配置用于密封在所述腔室的所述第二端的第二开口；和柱塞，所述柱塞至少部分地可移动地布置在所述腔室内，其中所述柱塞被配置成被致动以打开所述密封部分；使所述离心浓缩器离心以从置于所述腔室内的所述血液样品中浓缩所述微生物；和从所述腔室的所述第二端的所述第二开口压出浓缩的微生物，优选地从所述离心浓缩器的所述第二端无菌压出沉淀到小瓶或测定装置中。19.如权利要求18所述的方法，其中所述离心浓缩器不包括用于将所述微生物与所述裂解物分离的密度垫或物理分离器。20.如权利要求18所述的方法，其中所述方法不包括以下中的一个或多个：在第一容器中混合所述血液样品和所述差异裂解缓冲液，然后将所述裂解物转移至所述离心浓缩器、包括所述离心浓缩器中除所述血液样品和所述差异裂解缓冲液之外的组分，在离心后打开所述离心浓缩器以倒出上清液部分，在将所述血液样品与所述差异裂解缓冲液混合之前的培养步骤，或在所述裂解物中消化基因组DNA的DNA酶步骤。21.如权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括以下中的一个或多个：在将所述血液样品与所述差异裂解缓冲液混合之前的培养步骤，或在所述裂解物中消化基因组DNA的DNA酶步骤。22.如权利要求1所述的方法，其中通过过滤技术从所述裂解物中浓缩所述微生物。23.如权利要求22所述的方法，所述方法进一步包括将其上具有浓缩的微生物的过滤器添加到以下中的一个或多个：被配置用于鉴定所述血液样品中存在的所述微生物的培养设备或测定装置。24.如权利要求1所述的方法，其中将所述血液样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：拜奥梅留克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：