鸡传染性法氏囊抗体检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术一方面公开了一种特异性结合鸡传染性法氏囊VP2蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体为单克隆抗体1C4，该单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还公开了一种鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条，所述快速检测试纸条由试纸条和处理液组成，所述试纸条包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；试纸条的乳胶微球垫为乳胶微球标记鸡传染性法氏囊VP2蛋白；试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测线和质控线，其中质控线为单克隆抗体1C4，检测线为鸡传染性法氏囊VP2蛋白。本发明专利技术制备的单克隆抗体1C4具有良好的特异性和敏感性，适用于制备不同的鸡传染性法氏囊诊断试剂。备不同的鸡传染性法氏囊诊断试剂。备不同的鸡传染性法氏囊诊断试剂。

【技术实现步骤摘要】
鸡传染性法氏囊抗体检测试剂盒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及鸡传染性法氏囊抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]鸡传染性法氏囊病(IBD)又称鸡传染性腔上囊病(IBDV)，是由传染性法氏囊病毒引起的一种急性、接触传染性疾病。传染性法氏囊病毒属于双RNA病毒科，包括两个血清型。以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征。从而引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果。发病率高，几乎达100％，死亡率低，一般为5％～15％，是养禽业最重要的疾病之一。
[0003]自然条件下，本病只感染鸡，所有品种的鸡均可感染，但不同品种的鸡中，白来航鸡比重型品种的鸡敏感，肉鸡较蛋鸡敏感。本病仅发生于2周
‑‑
15周的小鸡，3～6周龄为发病高峰期。病毒主要随病鸡粪便排出，污染饲料、饮水和环境，使同群鸡经消化道、呼吸道和眼结膜等感染；各种用具、人员及昆虫也可以携带病毒，扩散传播；本病还可经蛋传递。
[0004]传染性法氏囊病毒属于双股RNA病毒科禽双股RNA病毒属。病毒颗粒无囊膜，直径60nm，有一层外壳，20面对称，基因组含A.B两个线状双股RNA分子，大小6kbp，病毒对热(60℃30min)稳定，在ph3
‑
9、经乙醚或氯仿处理均不丧失其活性。病毒的复制对细胞的RNA及蛋白质的合成无明显影响，病毒在胞浆组装并蓄积。
[0005]检测鸡IBDV抗体的主要方法有：中和试验、琼扩、间接免疫荧光(IFA)及ELISA。中和试验虽然是评价鸡群抗体的金标准，但因其操作繁琐，耗时较长，且需要培养细胞，不适合普通养殖场的使用。琼扩实验虽然操作不复杂，但不够灵敏且耗时较长，达不到快速和灵敏的目的。IFA操作也比较繁琐，需要培养细胞，且观察需要用的荧光显微镜价格昂贵。ELISA具备特异、简便、快速的特点。因此，目前普遍使用间接EILSA来评价鸡群内的IBDV抗体水平。但针对养殖户来说，ELISA操作依然需要专业人员和专业设备，因此，也不适合在养殖场的现场使用。

技术实现思路

[0006]为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的之一，提供一种鸡传染性法氏囊VP2蛋白的单克隆抗体；本专利技术的目的之二，提供一种使用本专利技术制备的VP2蛋白和单克隆抗体制备鸡传染性法氏囊抗体检测试剂盒。
[0007]因此，本专利技术一方面公开了一种鸡传染性法氏囊单克隆抗体，所述的单克隆抗体能特异性结合鸡传染性法氏囊VP2蛋白，所述的单克隆抗体为单克隆抗体1C4，所述的单克隆抗体1C4的重链可变区序列和轻链可变区如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0008]再一方面，本专利技术还公开了一种鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条，所述鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条由试纸条和处理液组成，所述试纸条包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；试纸条的乳胶微
球垫为乳胶微球标记鸡传染性法氏囊VP2蛋白；试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测线和质控线，其中质控线为单克隆抗体1C4，检测线为鸡传染性法氏囊VP2蛋白。
[0009]优选地，本专利技术所述的样品处理液为1
×
PBS溶液。
[0010]优选地，本专利技术所述的试纸条适用于检测血清、血液和组织液中的鸡传染性法氏囊抗体。
[0011]优选地，本专利技术所述的组织液为唾液。
[0012]再一方面，本专利技术还公开了一种所述的单克隆抗体1C4在制备鸡传染性法氏囊抗体检测试剂中的应用。
[0013]本专利技术所提供的鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条适用于血清、全血和组织液(如唾液)中鸡传染性法氏囊抗体的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于鸡传染性法氏囊抗体的早期筛查，特别适合现场鸡传染性法氏囊感染诊断、流行病学调查和国际贸易检疫检验等。
[0014]本专利技术用于制备试纸条的鸡传染性法氏囊VP2蛋白的单克隆抗体1C4，具有良好的特异性和敏感性，也适用于制备不同的鸡传染性法氏囊诊断试剂，如胶体金、试纸条、ELISA、化学发光检测等。
附图说明
[0015]图1、两株单克隆抗体的特异性检验结果(western blot)；其中图1A为单克隆抗体1C4检测结果，图1B为单克隆抗体3B7检测结果；两图中M均为Marker、1均为鸡传染性法氏囊、2均为鸡新城疫、3均为鸡传染性支气管炎病毒、4均为鸡传染性喉气管炎病毒。
[0016]图2、检测试纸条的组装，其中1是样品垫，2是胶体金垫，3是硝酸纤维素膜，4是吸水垫，5是检测线，6是质控线，7是PVC板。
[0017]图3、试纸条内包装成品图，其中C为质控线、T为检测线、S为加样槽。
[0018]图4、试纸条检测判定模式图。
具体实施方式
[0019]以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。
[0020]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0021]实施例1：鸡传染性法氏囊VP2蛋白单克隆抗体的制备和鉴定
[0022]1、鸡传染性法氏囊VP2蛋白的制备
[0023]参见中国专利技术专利202010597896.1【0016】～【0034】段的方法制备鸡传染性法氏囊VP2蛋白，共制备了一批蛋白，蛋白约20mg，其浓度为1.12mg/ml，定量(0.2ml/管)分装后置于
‑
80℃保存。
[0024]2、杂交瘤细胞的筛选
[0025]用1中制备的鸡传染性法氏囊VP2蛋白免疫6～8周龄的BALB/c雌性小鼠，首次免疫时，鸡传染性法氏囊VP2蛋白与弗氏完全佐剂等体积乳化，腹腔接种小鼠，100μg蛋白/只；14天后鸡传染性法氏囊VP2蛋白与弗氏不完全佐剂等体积乳化，第二次腹腔接种途径免疫小鼠，100μg蛋白/只；14天后第三次小鼠腹腔途径直接免疫鸡传染性法氏囊VP2蛋白，100μg/
只；免疫后的第3天，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。
[0026]使用PEG法将小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用HAT培养基重悬，均匀铺于96孔板内，每孔100μl，37℃，5％CO2培养。细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10～30％时。取培养上清，用间接ELISA方法(鸡传染性法氏囊VP2蛋白包被，1μg/ml)进行阳性克隆的检测。选择2个呈强阳性反应的细胞孔，进行3次有限稀释法细胞克隆，各获得一株杂交瘤细胞。经传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，液氮保存备用。
[0027]通过以上步骤，共筛选冻存2株杂交瘤细胞，分别命名为杂交瘤细胞1C4、杂交瘤细胞3B7。
[0028]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡传染性法氏囊单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体能特异性结合鸡传染性法氏囊VP2蛋白，所述的单克隆抗体为单克隆抗体1C4，所述的单克隆抗体1C4的重链可变区序列和轻链可变区如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。2.一种鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条，其特征在于，所述鸡传染性法氏囊抗体快速检测试纸条由试纸条和处理液组成，所述试纸条包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；试纸条的乳胶微球垫为乳胶微球标记鸡传染性法氏囊VP2蛋白；试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡昌红，周侃均，白青月，胡振，强文俊，殷复建，谢宏权，
申请(专利权)人：宁波纯派农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：