一种用于昆虫细胞DNA残留含量定量检测的引物探针及其方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种昆虫细胞DNA残留含量定量检测的引物和探针，以及通过上述引物和探针检测昆虫Sf9细胞DNA残留量的方法。本发明专利技术还涉及一种包含上述引物和探针的试剂盒。本发明专利技术的引物和探针、检测方法和试剂盒具有较高的特异性和灵敏度，可以很好地满足本领域中的检测需求。利用本发明专利技术的引物和探针、检测方法及试剂盒，能够高效、快速、灵敏、准确地检测昆虫Sf9细胞残留DNA的水平和含量，并且在各种检测环境和条件下均能保持很高的灵敏度和准确性，可广泛地应用于昆虫细胞

【技术实现步骤摘要】
一种用于昆虫细胞DNA残留含量定量检测的引物探针及其方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因监测领域，更具体的，涉及一种用于检测昆虫细胞DNA残留含量定量检测的方法和用途。

技术介绍

[0002]残留在宿主细胞的DNA不仅会影响生物制品的纯度和安全性，还存在潜在的致癌性，因此需严加控制和监测。荧光定量PCR技术能够针对不同宿主DNA细胞进行特异性检测，经过二十年的发展，实时荧光定量PCR技术(qPCR)具有高灵敏度和高特异性。
[0003]实时荧光定量PCR技术(qPCR)已经被广泛应用于临床疾病诊断各种传染病诊断和疗效评价；临床疾病诊断动物疾病检测；食源微生物、食品过敏源、转基因研究等食品安全操作等等各个领域。qPCR主要是利用插入性染料或荧光探针(比如TaqMan)，人们可以通过监控PCR过程中的荧光强度比较多个样品的DNA水平。而探针法中的荧光信号只来源于目标序列，不受非特异性扩增及引物二聚体的影响，特异性和准确性方面远远优于廉价的染料法。
[0004]TaqMan探针根据其3
’
端标记的荧光淬灭基团的不同又分为两种；普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non
‑
Flourescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时，探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此，MGB探针可以比普通探针设计的更短，既降低合成成本，也使探针设计的成功率大大提高。因为在模板的DNA碱基组成不合理的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中的问题，本专利技术提供了一种检测昆虫细胞残留DNA的引物、探针以及残留DNA含量定量检测的方法和应用。采用本专利技术的引物和探针，可以稳定准确特异性检测昆虫细胞残留DNA，通过实时荧光定量PCR(Q
‑
PCR)检测。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种检测昆虫细胞残留DNA的引物和探针，所述引物和探针的序列为：
[0007]上游引物：5
’‑
AAAAGATAGAAACCAACCTGGCTTAC
‑3’
(SEQ ID NO：1)；
[0008]下游引物：5
’‑
CGACCTCGATGTTGGATTAAGAT
‑3’
(SEQ ID NO：2)；
[0009]探针：5
’‑
CCGGTTTGAACTCAG
‑3’
(SEQ ID NO：3)。
[0010]进一步的，所述探针的5
’
端连接有荧光报告基团，3
’
端连接有荧光淬灭基团，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、HEX或VIC中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ或MGB中的任意一种。
[0011]进一步的，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为MGB。
[0012]本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测样品中Sf9细胞DNA残留量的方法，采用上述的引物和探针对待测样品进行检测。
[0013]进一步的，所述方法的步骤包括：
[0014](1)对待测样品进行处理，提取样品中的DNA作为模板待用；
[0015](2)配制反应体系，所述反应体系包括：模板，上游引物，下游引物，探针，聚合酶等成分；
[0016](3)进行实时荧光定量PCR反应。
[0017]进一步的，所述实时荧光定量PCR反应体系为：
[0018][0019]进一步的，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：
[0020]第一步：95℃30sec，1个循环；
[0021]第二步：(95℃5sec，60℃30sec)，40个循环。
[0022]进一步的，所述方法还包括建立标准曲线的步骤，将阳性定量标准品以10倍梯度进行稀释，以此作为模板进行实时荧光定量PCR检测，从而建立标准曲线。
[0023]进一步的，所述结果判定是根据标准曲线来计算待测样品中Sf9细胞DNA的残留量。
[0024]本专利技术的第三个目的在于提供一种用于检测样品中Sf9细胞DNA残留量的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1
‑
3中任一项所述的引物和探针，所述试剂盒还包含实时荧光定量PCR扩增试剂、阳性定量标准品和/或阴性对照。
[0025]相比于现有技术，本专利技术的有益效果：
[0026]1、本专利技术的引物和探针、检测方法、试剂盒具有非常高的特异性和灵敏度，而且也具有很高的扩增效率，能够稳定、准确、灵敏、快速地检测出Sf9细胞DNA残留，实时荧光定量qPCR可检测的最低浓度为10copies/μl，而常规qPCR可检测的最低浓度为1.0
×
104copies/μl，说明本研究建立的实时荧光定量qPCR敏感性比常规PCR高。
[0027]2、本专利技术的引物和探针、检测方法、试剂盒可广泛地应用于昆虫细胞
‑
杆状病毒表达系统生产的基因治疗产品、疫苗、蛋白类产品的质控，具有很高的应用价值。
附图说明
[0028]图1为pMD18
‑
T
‑
sf9质粒酶切鉴定；
[0029]图2为实时荧光定量RT
‑
PCR动力学曲线；
[0030]图3为实时荧光定量RT
‑
PCR标准曲线；
[0031]图4为实时荧光定量RT
‑
PCR动力学曲线(特异性试验)；
[0032]图5为常规PCR反应(敏感性试验)；
具体实施方式
[0033]以下实施例只用于解释本专利技术，并非限定本专利技术的保护范围。
[0034]下述实施例中所提的试剂原料均为市售常见原料，实际配制采用常规方法，实施例中未详细描述的方法均为本领域常规操作。
[0035]本专利技术实施例中所涉及的材料与方法
[0036]1、供试品
[0037]供试品是用表达重组蛋白的杆状病毒感染昆虫细胞(sf9和High Five)，待细胞病变后，从细胞培养液中分离的重组蛋白或病毒样颗粒，病毒样颗粒灭活后得重组蛋白灭活疫苗。
[0038]2、标准基因组DNA
[0039]sf9细胞经扩大培养后，按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取细胞DNA，经NanoDrop2000紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。
[0040]3、主要试剂和仪器
[0041]病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒(柱提法)购自武汉科前生物股份有限公司；pMD18
‑
T载体购自大连宝生物工程有限公司；DL2000 maker本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组用于昆虫Sf9细胞DNA残留量检测的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的序列为：上游引物：5
’‑
AAAAGATAGAAACCAACCTGGCTTAC
‑3’
(SEQ ID NO：1)；下游引物：5
’‑
CGACCTCGATGTTGGATTAAGAT
‑3’
(SEQ ID NO：2)；探针：5
’‑
CCGGTTTGAACTCAG
‑3’
(SEQ ID NO：3)。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的5
’
端连接有荧光报告基团，3
’
端连接有荧光淬灭基团，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、HEX或VIC中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ或MGB中的任意一种。3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为MGB。4.一种用于检测样品中Sf9细胞DNA残留量的方法，其特征在于，采用权利要求1
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：周明光，徐高原，张华伟，朱娴静，尹争艳，苏秀婵，陈斌，王菁菁，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：