一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法技术

本发明专利技术涉及一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，属于植物分子生物学技术和基因工程技术领域。该方法包括以下步骤：

【技术实现步骤摘要】
一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法


[0001]本专利技术属于植物分子生物学技术和基因工程
，具体涉及一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法。

技术介绍

[0002]随着多组学测序技术在植物上的广泛应用，研究者们获得了海量的序列信息和差异表达基因/蛋白/代谢产物。如何在基因大数据时代利用好这些数据资源、进行功能基因的挖掘已成为新时代的重要课题。转基因技术是开展基因功能研究的重要手段，该技术基于一系列现代生物技术，将研究者们感兴趣的目标基因，经过克隆和重组后，导入并整合到受体生物的基因组中，从而达到改良受体性状或赋予其他优良性状的目的。但是对于大多数植物，尤其是多年生果树来说，除了苹果和柑橘等，大多数果树因转化效率低和植株难以再生等诸多因素，转基因体系尚不成熟。转基因体系的缺失，已经成为果树功能基因研究的主要限制因子，也是影响果树分子生物学发展的瓶颈。目前，国际高水平期刊日趋强调要基于同源物种开展基因功能验证，因此，耗时短、效率高的基因瞬时表达技术获得了越来越多的关注。
[0003]植物瞬时表达技术是一种获得目的基因短暂的高水平表达的技术。与稳定表达相比，瞬时表达转化效率高、所需时间短，在启动子分析、蛋白互作和基因功能验证等方面应用广泛。瞬时转化的方法主要有基因枪法和农杆菌介导法。
[0004]基因枪法对硬件设备的要求较高，只有较少部分的组织或细胞符合基因枪法的转化要求，且所得转基因植物组织较少，难以满足部分性状后续分析所需样品量。
[0005]农杆菌介导的转化属于纯生物学的过程，属于一种天然的植物基因转化系统，具有通用性高、可操作性强、转化频率高、表达效果好等特点。
[0006]基于农杆菌介导的基因瞬时表达技术，在近几年取得了迅速的发展和完善，但在部分果树的果实上的可行性较差，其应用仍然有限，目前仅在果皮肥厚的柑橘果实、膨压较小的梨果实等得以应用，在柑橘、梨果实中，研究者们均采用注射器直接注射到果实组织中，实现目的基因的瞬时表达。
[0007]葡萄是我国的重要经济作物，目前已经有了较完善的基因组数据和注释信息，为葡萄功能基因的研究提供了极大便利。但是由于葡萄的发育期长，缺乏完善的再生体系，因此，亟需开发葡萄果实中基于瞬时表达技术进行功能验证的方法。然而，基因枪法对硬件设备要求较高，且获得的转化材料较少，难以满足后续的实验分析；农杆菌介导技术中的注射法向葡萄果实注入外源液体，会使组织破裂，不适用于果皮单薄、膨压较大的葡萄果实。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，能够实现果皮单薄、膨压较大的葡萄基因的瞬时表达。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：
[0010]一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，包括以下步骤：
[0011](1)选择成熟度在果实膨大期结束到商业采收期之间的果实，去除葡萄果皮，制作葡萄果肉组织切片；
[0012](2)将葡萄果肉组织切片在MS固体培养基上进行易感培养，获得易感状态的葡萄果肉组织切片；
[0013](3)将易感状态的葡萄果肉组织切片浸没于含有目标载体的农杆菌浸染液中，然后进行抽真空处理，保压，再释放真空至常压，取出浸染后的葡萄果肉组织切片；
[0014](4)对浸染后的葡萄果肉组织切片进行清洗，然后培养，确定瞬时表达结果。
[0015]本专利技术的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，适用于果皮单薄、果肉组织膨压较大的葡萄果实，具有操作简单、转化效率高的优点，为在葡萄果实中开展基因功能研究及功能基因的筛选提供了技术支持。
[0016]进一步地，所述易感培养是将葡萄果肉组织切片放在MS固体培养基上，于24～26℃、黑暗条件下培养36～48h。易感培养让葡萄果肉更易接受外源基因，同时易感培养能够减少后续浸染对葡萄果肉的伤害，起到缓冲的作用。
[0017]进一步地，所述含有目标载体的农杆菌浸染液包括含有目标载体的农杆菌、浸染液和表面活性剂。所述浸染液为含有氯化镁、2
‑
(N
‑
吗啡啉)乙磺酸、乙酰丁香酮的水溶液。所述氯化镁、2
‑
(N
‑
吗啡啉)乙磺酸、乙酰丁香酮的摩尔比为50:50:1。所述浸染液的pH为5.6～5.7。所述氯化镁的摩尔浓度为10mM。
[0018]进一步地，所述含有目标载体的农杆菌的培养包括以下步骤：将目标基因构建到植物表达载体上，得到基因表达载体，将基因表达载体转入农杆菌GV3101，在含有相应抗生素的LB固体培养基上28℃培养2d后，挑取单克隆，经PCR鉴定后，用含有相应抗生素的LB液体培养基培养，扩大培养体系至50～100mL，培养至OD
600
＝0.8～1.0后，在常温下离心。更进一步地，离心的转速为6000rpm，时间为10min。
[0019]本专利技术中的载体是常规载体形式，应用时无特殊要求，所用载体包含表达载体的基本构成元件：目的基因、启动子、终止子、标记基因。本专利技术中使用的载体是包含组成型启动子的表达载体。
[0020]进一步地，所述植物表达载体为pCAMBIA0390。
[0021]进一步地，利用冻融法将基因表达载体转入农杆菌GV3101。
[0022]进一步地，所述表面活性剂为聚环醚改性聚二甲基硅氧烷。所述表面活性剂在浸染液中的体积分数为0.03％～0.05％。
[0023]进一步地，所述表面活性剂为南京沃博生物科技有限公司的Silwet L
‑
77。
[0024]进一步地，所述含有目标载体的农杆菌浸染液采用包括以下步骤的方法制得：将浸染液与占浸染液0.05wt％的聚环醚改性聚二甲基硅氧烷混合，得到混合液，然后将混合液与所述含有目标载体的农杆菌混合，在摆动式振荡摇床或往复式振荡摇床上，90rpm下孵育4h。
[0025]进一步地，所述抽真空处理是抽真空至
‑
70～
‑
80kPa。
[0026]进一步地，所述保压的时间为5～15min。更进一步地，保压的时间优选为15min。
[0027]进一步地，步骤(4)中，所述培养是将清洗后的葡萄果肉组织切片放在MS固体培养基上，于24～26℃培养72～78h。
[0028]进一步地，步骤(1)中，所述葡萄果肉组织切片的厚度为0.5～1cm，面积为1cm2。
[0029]进一步地，在去除葡萄果皮前，用无菌蒸馏水清洗葡萄果实，然后用乙醇溶液浸泡葡萄果实，再用次氯酸钠溶液浸泡葡萄果实，最后用无菌蒸馏水清洗。更进一步地，用乙醇溶液浸泡葡萄果实的时间为1min，用次氯酸钠溶液浸泡葡萄果实的时间为20min。
[0030]进一步地，所述乙醇溶液为等体积的无菌蒸馏水和无水乙醇混合均匀后的溶液，乙醇溶液的体积分数为50％。所述次氯酸钠溶液的有效氯含量为2.5wt％。
[0031]进一步地，所述确定瞬时表达结果选择GU本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选择成熟度在果实膨大期结束到商业采收期之间的果实，去除葡萄果皮，制作葡萄果肉组织切片；(2)将葡萄果肉组织切片在MS固体培养基上进行易感培养，获得易感状态的葡萄果肉组织切片；(3)将易感状态的葡萄果肉组织切片浸没于含有目标载体的农杆菌浸染液中，然后进行抽真空处理，保压，再释放真空至常压，取出浸染后的葡萄果肉组织切片；(4)对浸染后的葡萄果肉组织切片进行清洗，然后培养，确定瞬时表达结果。2.根据权利要求1所述的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，所述易感培养是将葡萄果肉组织切片放在MS固体培养基上，于24～26℃、黑暗条件下培养36～48h。3.根据权利要求1所述的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，所述含有目标载体的农杆菌浸染液包括含有目标载体的农杆菌、浸染液和表面活性剂；所述浸染液为含有氯化镁、2
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(N
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吗啡啉)乙磺酸、乙酰丁香酮的水溶液；所述氯化镁、2
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吗啡啉)乙磺酸、乙酰丁香酮的摩尔比为50:50:1；所述浸染液...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴茂松，刘海楠，韦同路，郭大龙，余义和，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：