本发明专利技术公开了一种牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用。属于生物医药技术领域。所述牙髓间充质干细胞外泌体由3D悬浮培养牙髓间充质干细胞产生的培养液提取所得，所述牙髓间充质干细胞来源于离体乳牙。从牙髓间充质干细胞制备的胞外囊泡具有外泌体的典型特征；制备的牙髓间充质干细胞外泌体具有提高软骨细胞活力，促进软骨细胞增殖和迁移的活性；在小鼠关节软骨损伤模型中，制备的牙髓间充质干细胞外泌体可显著促进软骨修复，并且进一步在临床试验中，牙髓间充质干细胞外泌体对于退行性膝关节炎患者中的疼痛，僵直以及生活质量有显著的改善。有显著的改善。有显著的改善。
【技术实现步骤摘要】
一种牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用
[0001]本专利技术涉及生物医药
，更具体的说是涉及一种牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用。
技术介绍
[0002]软骨由胶原蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、糖蛋白、少许细胞、以及60～80％的水分等构成。软骨细胞与周围的胞外基质(ECM)共同构成软骨单位，被视为软骨的主要结构、功能及代谢单位。在正常软骨中，软骨细胞通过合成胶原蛋白、蛋白聚糖及糖胺聚糖等物质，用以维持软骨稳态或置换损坏软骨。软骨在人体中具有承重负荷、减少关节间骨骼摩擦等重要作用。然而，成人软骨组织中缺乏血管或神经，因此受伤软骨组织自行修复能力十分有限。软骨功能缺损常与退行关节病发生密切相关，如退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等。
[0003]骨关节炎(osteoarthritis，OA)是由多种因素引起的关节退行性疾病，病理特点包括关节软骨变性破坏、滑膜炎、软骨下骨硬化或囊性变、关节边缘骨质增生、骨赘形成等症状。OA的发病与年龄、创伤、炎症、肥胖、劳损等诸多因素有关。随着人口的老龄化加剧和肥胖人群比例的增多，OA的发病率不断升高，65岁以上年龄段的发病率高达80％，OA已成为第四大致残性疾病。OA不仅会严重影响患者的生活质量，还会给患者家庭及社会带来严重的经济负担。目前的治疗方式主要是早期口服药物或者关节腔注射玻璃酸钠，实现短期内缓解症状的疗效；中晚期采取微骨折术、软骨移植术、关节置换术等手术治疗，但存在着软骨来源少、再生能力差、术后活动严重受限等诸多缺点。迄今为止，还没有有效的治疗方法可改变OA的病理进展。软骨细胞的再生能力差，OA早期炎症反应会加速软骨的不可逆损伤，进而导致关节组织进行性结构改变，形成慢性炎症，进一步加重OA的疾病进程。目前临床上仍缺乏治疗OA的有效方法。
[0004]近年来，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为软骨组织工程领域的研究重点，被认为是治疗OA的新希望。关节腔内注射间充质干细胞已被用于治疗OA，其能够缓解膝关节疼痛，改善软骨质量。但MSCs引发的移植排斥、肿瘤风险等问题尚待解决。
[0005]目前，干细胞治疗OA已进行了大量体内外实验，但是干细胞治疗OA存在较多问题如：
①
诱导的干细胞定向分化的信号通路及相关机制不明确；
②
临床试验设计、注射时间和移植方案有待进一步的标准化；
③
干细胞移植还存在细胞成活率低的问题；
④
干细胞移植后只有极少数的细胞分化为软骨细胞；
⑤
最为重要的问题是难以长期预测体内移植细胞的状态，且移植体内后向非治疗目的细胞分化，可能发生副作用。近年来的研究报道发现干细胞移植后注入关节的干细胞中只有一小部分分化为软骨细胞，促进关节组织的再生和修复并不是由于干细胞定向分化能力，而主要由于其旁分泌作用。目前发现的在关节软骨损伤中干细胞通过旁分泌作用可以向细胞外持续分泌多种细胞因子和细胞外囊泡等生物活性物质，调节损伤部位微环境，改善炎症等途径提高局部细胞的再生，进而促进组织的再生修复。应用干细胞外泌体进行的研究结果表明外泌体具有类似于干细胞的治疗效果，因此应
用干细胞外泌体进行OA及其他疾病的治疗已成为研究热点。
[0006]外泌体起源于内体系统，内体通过依赖转运所需分选复合体(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)或不依赖ESCRT机制的途径以内出芽的方式形成腔内小泡，隔离特定胞质游离的蛋白质、脂质、核酸或其他胞浆物质形成多泡体。大部分多泡体被溶酶体溶解，少部分通过膜融合由内分泌和旁分泌途径从细胞中释放出来，形成外泌体。外泌体可以通过与质膜直接融合，或与受体相互作用，或通过内吞作用与核内体融合，选择性地靶向受体细胞。最初外泌体被认为是细胞产生的“废物”，随着研究的深入学者们发现外泌体在各种病理或生理状态下均有重要功能，包括调节细胞代谢、控制炎症、促进血管新生、促进组织修复、免疫调节等功能。而且外泌体是细胞外囊泡的重要组成部分，可参与多种生理过程，包括细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解、炎症、血管生成和抗原呈递等。此外，外泌体可以作为重要的信号信使和载体，将信号传递给相应的靶细胞，从而改变其生理功能和状态。在MSCs治疗OA的过程中，主要利用MSCs旁分泌的外泌体发挥组织修复功能，并且外泌体可抑制OA的病程发展，而且在维持关节腔微环境稳态方面具有重要作用。
[0007]综上，如何提供一种具有修复软骨损伤功能的外泌体是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
[0008]有鉴于此，本专利技术提供了一种牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]一种牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
[0011](1)牙髓间充质干细胞的获得；
[0012](2)牙髓间充质干细胞的3D培养：
[0013]将微载体溶解在3D悬浮培养瓶中，之后将牙髓间充质干细胞接种到微载体上，至于37℃含5％CO2的条件下培养，收集培养上清；
[0014](3)牙髓间充质干细胞外泌体的提取：
[0015]将所述培养上清依次经离心、膜过滤、浓缩、PEG
‑
base沉淀即可。
[0016]进一步的，步骤(1)中所述牙髓间充质干细胞取自离体的儿童乳牙。
[0017]进一步的，所述步骤(2)中牙髓间充质干细胞的接种密度为5000～7000cell/cm2。
[0018]进一步的，所述步骤(2)的具体培养条件为：
[0019]接种后前24小时的参数设置为25～80rpm，5～10min；0rpm，60～120min交替培养；
[0020]24小时后的参数设置为30～60rpm持续培养；
[0021]培养至第3天，开始收集D3,D5,D7,D9的培养上清，且每2天更换一次新的培养基，直至第9天收集培养上清结束，混合后备用。
[0022]进一步的，所述步骤(3)中离心的具体操作为：依次在4℃条件下进行300
×
g，5min；2000
×
g，15min；10000
×
g，10min的离心处理。
[0023]进一步的，所述步骤(3)中膜过滤为经0.22μm PES滤膜过滤。
[0024]进一步的，所述步骤(3)中的浓缩为浓缩至初始体积的1/10～1/25。
[0025]进一步的，所述步骤(3)中PEG
‑
base沉淀的具体操作为：将浓缩后的培养上清与
PEG
‑
base以3：1～5：1的体积比混匀后4℃沉淀2小时，10000
×
g，4℃离心1小时，弃掉离心上清，加入生理盐水重悬沉淀，12000
...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)牙髓间充质干细胞的获得；(2)牙髓间充质干细胞的3D培养：将微载体溶解在3D悬浮培养瓶中，之后将牙髓间充质干细胞接种到微载体上，至于37℃含5％CO2的条件下培养，收集培养上清；(3)牙髓间充质干细胞外泌体的提取：将所述培养上清依次经离心、膜过滤、浓缩、PEG
‑
base沉淀即可。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述牙髓间充质干细胞取自离体的儿童乳牙。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中牙髓间充质干细胞的接种密度为5000～7000cell/cm2。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体培养条件为：接种后前24小时的参数设置为25～80rpm，5～10min；0rpm，60～120min交替培养；24小时后的参数设置为30～60rpm持续培养；培养至第3天，开始收集D3,D5,D7,D9的培养上清，且每2天更换一次新的培养基，直至第9天收集培养上清结束，混合后备用。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心的具体操作...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟采桦，杜杰杰，
申请(专利权)人：河北森朗泰禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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