一种柯萨奇病毒A6型感染恒河猴手足口病模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种柯萨奇病毒A6型感染恒河猴手足口病模型的构建方法，包括CVA6病毒通过呼吸道或消化道滴注感染恒河猴造模，本发明专利技术是一种CVA6感染恒河猴手足口病模型的构建方法，与现有技术相比，建模方法时间短、简单易行、死亡率低且模型稳定，同时，鼻腔滴注或者口腔滴注为更接近人类肠道病毒感染的真实途径，较好地反映了CVA6感染的整个过程，为该病原模型的建立提供更优化的方法和技术支持。型的建立提供更优化的方法和技术支持。型的建立提供更优化的方法和技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种柯萨奇病毒A6型感染恒河猴手足口病模型的构建方法


[0001]本专利技术涉及一种构建手足口病模型处理技术，尤其涉及一种柯萨奇病毒A6型感染恒河猴手足口病模型的构建方法。

技术介绍

[0002]肠道病毒是无包膜的球形病毒二十面体球形颗粒，可以引发人类特别是婴幼儿的多种疾病，同时诸如EV71、CVA16、CVA6、CVA10等已经成为引起婴幼儿手足口流行的主要的优势流行株。目前，手足口病流行株不断发生变化，CVA6作为肠道病毒中主要的成员，是儿童手足口病的主要病原之一。此外，CVA6感染婴幼儿常引起高热、蜕皮、脱甲、皮疹变化显著等临床症状，其皮疹主要表现在手掌、脚底、口周的非典型性特征。同时CVA6易与其他肠道病毒交叉混合感染后通过病毒基因重组等形成新的变异毒株，进而导致毒株感染性增强。针对CVA6感染的手足口病尚无有效的抗病毒药物或疫苗，因此需要开展CVA6感染引起手足口病的相关研究。
[0003]理想的疾病动物模型是研究病毒在体内入侵、复制、致病、传播以及转归等机理，以及评价疫苗药物有效和安全性等的重要支撑条件。目前用于研究CVA6最常用的动物模型为啮齿类—乳鼠、小鼠模型，感染后小鼠所表现出的临床症状和病理特征与手足口病有相似之处。但由于新生乳鼠与人类相比，遗传学差异较大、体型小、实验观察周期短。同时小鼠的免疫系统尚未发育完全，对相关免疫反应及评价有明显缺陷。多数小鼠模型采取腹腔注射等非自然感染方式等局限性，模型仅能模拟手足口病某一个或几个临床症状，尚不能完整反映CVA6感染的临床特征和致病机理。因此，需要一种CVA6感染灵长类实验动物
‑
恒河猴手足口病模型的构建方法。

技术实现思路

[0004]为解决上述的技术问题，本专利技术提供一种CVA6感染灵长类实验动物
‑
恒河猴手足口病模型的构建方法和用途。
[0005]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：包括如下步骤：选取恒河猴通过呼吸道或消化道的滴注感染CVA6病毒的形式造模。
[0006]进一步地，所述恒河猴年龄选取3
‑
4月幼龄动物。
[0007]进一步地，感染前将CVA6病毒制成混悬液，所述CVA6滴注感染的悬液滴度为106CCID
50
/mL，滴注病毒悬液量为100μL。
[0008]提供一种柯萨奇病毒A6型感染恒河猴手足口病模型在评价治疗性药物或疫苗研发中的应用,提供一种模拟感染和免疫、病理生理等机制研究、以及新型药物疫苗筛选、安全性评价中的应用。
[0009]本专利技术的有益效果是：本专利技术是一种柯萨奇病毒A6型感染恒河猴手足口病模型的构建方法，与现有技术
相比，使用与人遗传、生理等最接近的、高等级的灵长类动物实验动物
‑
恒河猴，建模方法简单易行、成模时间短、检测指标全面、死亡率低且模型稳定。同时，鼻腔滴注方式更接近人类感染病毒的真实、自然途径，能较好反映病毒感染的整个过程，为CVA6感染的手足口病模型建立提供优化的方法和技术支持。
附图说明
[0010]图1为CVA6感染恒河猴0
‑
14天的临床观察。A感染组的恒河猴手、足、面部、口唇部位感染后2
‑
6天出现手足口病的典型临床症状；B监测恒河猴的体温变化；C监测恒河猴的体重变化；D监测恒河猴的血细胞变化，包括白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
[0011]图2为CVA6感染恒河猴后病毒在体内动态分布情况。A血液中CVA6病毒RNA的检测；B咽拭子中CVA6病毒RNA的检测；C粪便中CVA6病毒RNA的检测；D q
‑
RT
‑
PCR产物测序。
[0012]图3为呼吸道组猴子的行为、病原分布以及病理学分析。A A4猴子在感染后 0
‑
10天（d.p.i）的体温、体重情况；B A4猴子在0
‑
10 d.p.i的血液、咽拭子、粪便的病毒拷贝数动态变化情况；C 在感染后10天，A4猴子脑组织、内脏组织、免疫组织、肠道组织中的病毒核酸情况；D A4猴子组织的HE检测结果，用200
×
显微镜观察，依次为疱疹、肠系膜淋巴结、锁骨淋巴结、腋下淋巴结、肺门淋巴结、肺淋巴结；E A4猴子肠道组织（回肠、十二指肠）的HE和免疫组化检测结果。
[0013]图4为CVA6感染恒河猴12
‑
120天持续观察研究。A CVA6感染恒河猴12
‑
15天的临床症状评分；B CVA6感染恒河猴0
‑
20天的血清炎性因子的检测结果；C CVA6感染恒河猴0
‑
60天血液、咽拭子、粪便中病毒核酸动态监测；D CVA6感染恒河猴0
‑
14天血清肝功能、肾功能、心肌酶、血糖指标水平检测结果；E CVA6感染恒河猴14
‑
180天血清中和抗体水平检测结果。
具体实施方式
[0014]下面结合附图以及具体实施例对本专利技术作进一步描述，在此专利技术的示意性实施例以及说明用来解释本专利技术，但并不作为对本专利技术的限定。
[0015]下述实施例中的RD细胞为人横纹肌肉瘤细胞购自ECACC（UK），并通过CNIPB认证。该生物材料只为重复本专利技术的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0016]下述实施例中的MEM培养基为中国医学生物学医学生物学研究所制备。
[0017]下述实施例中的恒河猴均来自中国医学科学院医学生物研究所灵长类动物研究中心[实验动物生产许可证号:SCXK(滇)k2020
‑
0005]。符合国家标准的动物饲养设施内饲养[实验动物使用许可证编号：SYXK (滇) K2020
‑
0008]，温度26℃
‑
29℃，湿度40%
‑
60%。定时给予日粮，无限制地获得饮水。在实验开始前，所有的实验动物进行两周隔离检疫期。
[0018]下述实施例中的病毒株为RYN
‑
A1205(GenBank登录号:MN184852)。
[0019]实施例1 提供一种CVA6感染灵长类实验动物
‑
恒河猴手足口病模型的构建方法本研究选用体重0.6
‑
0.8 kg、3
‑
4月龄的健康、遗传背景清楚的新生恒河猴11只。在病毒感染实验前进行了血清中和试验筛查无CVA6的抗体。分组如下：呼吸道组RI经滴鼻方式感染，标记为A1、A2、A3、A4；消化道组DI经口服方式感染，标记为B1、B2、B3、B4；对照组CG不做任何处理，标记为C1、C2、C3。两个感染组的剂量均为1
×
105CCID
50
/猴(使用1mL注射
器10
5 CCID
50
/100μL)，确保病毒充分进入口鼻。
[0020]实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柯萨奇病毒A6型感染恒河猴手足口病模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：采取恒河猴通过呼吸道或消化道滴注感染CVA6病毒的形式造模。2.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A6型感染恒河猴手足口病模型的构建方法，其特征在于：所述恒河猴年龄选取3
‑
4月幼龄动物。3.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A6型感染恒河猴手足口病模型的构建方法，其特征在于: 感染前将CVA6病毒制成混悬液，所述CVA6滴注感染的悬液滴度为106CCID
50
/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：和占龙，段素琴，张伟，杨凤梅，李艳艳，李咏洁，靳玮华，徐鸿界，陈丽雄，李明学，刘权，邓自君，唐洁，孙文亭，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：