一种分枝多肽及其制备和应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程和基因治疗领域，公开了一种分枝多肽及其制备和应用。本发明专利技术通过分子设计使多肽分子呈现类似磷脂分子的两亲性，从而使具有低毒性的两亲性多肽与质粒DNA或mRNA完全结合，对细胞几乎无毒性，同时具有低毒性和转染效率高的优点。毒性和转染效率高的优点。毒性和转染效率高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种分枝多肽及其制备和应用


[0001]本专利技术涉及一种分枝多肽及其制备和应用，尤其涉及一种分枝多肽在制备用于基因治疗的基因转染系统中的应用，属于基因工程和基因治疗领域。

技术介绍

[0002]基因治疗是指使用核酸(如：质粒DNA(pDNA)和小分子干扰RNA(siRNA))，对患者的细胞进行遗传改造。许多人类疾病是由单个基因或一组基因的缺陷而引起基因突变所致，因此基因治疗通过纠正由基因突变或缺陷引起的功能丧失，为解决遗传性或获得性疾病提供了最佳解决方案。
[0003]基因治疗的关键是制备安全、高效的基因载体。在过去的几十年里，阳离子基因载体作为典型的非病毒载体受到极大重视。文献报道了很多聚阳离子化合物用于核酸的运载，例如：聚乙烯亚胺(PEI)、聚叔胺类甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚阳离子多糖等。阳离子脂质体因具有低毒性与免疫原性、生物相容性好、易于制备等优点也受到广泛关注，具有良好的应用前景。
[0004]然而，目前已有的基因载体通常不能同时兼顾高转染效率和低毒性，或者转染效率高毒性也高，或者毒性低转染效率也低。因此，在基因治疗中，亟需一种能够兼顾高转染效率和低毒性的基因载体。

技术实现思路

[0005]针对上述技术问题，本专利技术通过分子设计使多肽分子呈现类似磷脂分子的两亲性，从而使具有低毒性的两亲性多肽与pDNA或mRNA结合，进而压缩pDNA或mRNA，并将pDNA或mRNA携带进入细胞中进行表达。
[0006]为此，本专利技术一方面提供了一种多肽，其具有式(1)所示的结构：
[0007][0008]其中X优选为苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)，m为3
‑
8的整数，优选为5，n为2
‑
5的整数，优选为3；
[0009]所述多肽更加优选具有式(2)所示的结构：
[0010][0011]在本专利技术优选的方案中，所述多肽通过固相合成法制备而来。
[0012]本专利技术另一方面提供了制备本专利技术所述多肽的方法，其包括如下步骤：
[0013]1、树脂活化；
[0014]在本专利技术优选的方案中，优选采用MBHA rank amide树脂；
[0015]2、Fmoc保护基团脱除；
[0016]3、氨基酸循环偶联；
[0017]在本专利技术优选的方案中，偶联试剂优选为Fmoc
‑
AA
‑
OH(Fmoc保护的氨基酸)、HBTU(苯并三氮唑
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲六氟磷酸盐)和DIPEA(N,N
‑
二异丙基乙胺)；
[0018]在本专利技术更加优选的方案中，使用4倍当量的Fmoc
‑
AA
‑
OH(Fmoc保护的氨基酸)、4倍当量的HBTU(苯并三氮唑
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲六氟磷酸盐，浓度为400μM)和8倍当量的DIPEA(N,N
‑
二异丙基乙胺，浓度为800μM)进行偶联；
[0019]4、凯氏检测；
[0020]在本专利技术优选的方案中，凯氏检测液优选为：A检测液：2g茚三酮固体完全溶于50mL的无水乙醇溶液；B检测液：20g苯酚和5mL乙醇的混合溶液；和C检测液：氰化钾的吡啶稀溶液；
[0021]5、赖氨酸合成：重复步骤2～3直至7个赖氨酸合成完毕，其中第7个氨基酸使用双Fmoc保护的赖氨酸；
[0022]6、剩余氨基酸合成：称取步骤3中2倍量的Fmoc
‑
His(Trt)
‑
OH、2倍体积的HBTU和DIPEA，重复步骤3，偶合结束后重复步骤2，直至最后一个氨基酸合成完毕；
[0023]7、N端乙酰化；
[0024]在本专利技术优选的方案中，N端乙酰化试剂优选为：DMF、DIPEA和乙酸酐；
[0025]8、树脂真空干燥；
[0026]9、树脂切割；
[0027]在本专利技术优选的方案中，切割液优选为：三氟乙酸(TFA)：水：三异丙基硅烷(TIS)＝95：2.5：2.5；
[0028]10、多肽粗品制备；
[0029]11、多肽纯化；
[0030]在本专利技术优选的方案中，优选通过反相高效液相色谱进行多肽的纯化。
[0031]本专利技术另一方面提供了一种包含本专利技术所述的多肽的基因转染系统。
[0032]在本专利技术优选的方案中，所述多肽与质粒DNA或mRNA形成转染复合物。
[0033]在本专利技术更加优选的方案中，多肽中带正电的氨基氮元素与质粒DNA中带负电的磷酸基团中磷元素的摩尔比值(N/P)0.5
‑
40，进一步优选为2
‑
20，最优选为10或20。
[0034]在本专利技术更加优选的方案中，多肽中带正电的氨基氮元素与mRNA中带负电的磷酸基团中磷元素的摩尔比值(N/P)0.5
‑
16，进一步优选为2
‑
16，最优选为8或16。
[0035]本专利技术另一方面提供了制备本专利技术所述的基因转染系统的方法，包括如下步骤：
[0036]1、依据N/P值，制备不同浓度的本专利技术所述的多肽溶液；
[0037]2、制备质粒DNA或mRNA溶液；
[0038]3、将步骤1制备的多肽溶液添加至步骤2制备的质粒DNA或mRNA溶液中，振荡。
[0039]本专利技术另一方面提供了包含本专利技术所述的基因转染系统的药物组合物。
[0040]本专利技术另一方面提供了本专利技术所述的多肽在制备用于基因治疗的基因转染系统中的应用。
[0041]本专利技术再一方面提供了本专利技术所述的多肽、或本专利技术所述的基因转染系统在制备用于基因治疗的药物中的应用。
[0042]有益效果
[0043]本专利技术的分枝多肽及其制备和应用，与现有的基因载体相比，可以将多肽与质粒DNA或mRNA完全结合，对细胞几乎无毒性，同时具有低毒性和转染效率高的优点。
附图说明
[0044]图1是本专利技术实施例1制备的FFL
‑
K6多肽的液相色谱图；
[0045]图2是本专利技术实施例1制备的FFL
‑
K6多肽的质谱图；
[0046]图3是本专利技术实施例2的FFL
‑
K6多肽与pDNA结合的琼脂糖凝胶电泳图；
[0047]图4是本专利技术实施例3的FFL
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K6多肽与mRNA结合的琼脂糖凝胶电泳图；
[0048]图5是本专利技术实施例4的FFL
‑
K6多肽/pDNA复合物的粒径图；
[0049]图6是本专利技术实施例4的FFL
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K6多肽/pDNA复合物的Zeta电位图；
[0050]图7是本专利技术实施例5的FFL
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K6多肽/mRNA复合物的粒径图；
[0051]图8是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽，具有式(1)所示的结构：其中X优选为苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)，m为3
‑
8的整数，优选为5，n为2
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5的整数，优选为3；所述多肽更加优选具有式(2)所示的结构：所述多肽优选通过固相合成法制备而来。2.制备权利要求1所述多肽的方法，其包括如下步骤：(1)树脂活化，优选采用MBHA rank amide树脂；(2)Fmoc保护基团脱除；(3)氨基酸循环偶联：偶联试剂优选为Fmoc
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AA
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OH(Fmoc保护的氨基酸)、HBTU(苯并三氮唑
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲六氟磷酸盐)和DIPEA(N,N
‑
二异丙基乙胺)，更加优选使用4倍当量的Fmoc
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AA
‑
OH(Fmoc保护的氨基酸)、4倍当量的HBTU(苯并三氮唑
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲六氟磷酸盐，浓度为400μM)和8倍当量的DIPEA(N,N
‑
二异丙基乙胺，浓度为800μM)进行偶联；(4)凯氏检测，凯氏检测液优选为：A检测液：2g茚三酮固体完全溶于50mL的无水乙醇溶液；B检测液：20g苯酚和5mL乙醇的混合溶液；和C检测液：氰化钾的吡啶稀溶液；(5)赖氨酸合成：重复步骤(2)～(3)直至7个赖氨酸合成完毕，其中第7个氨基酸使用双Fmoc保护的赖氨酸；(6)剩余氨基酸合成：称取步骤(3)中2倍量的Fmoc
‑
His(Trt)

【专利技术属性】
技术研发人员：陈龙，袁秀双，罗施中，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：