肠道微生物来源的岩藻糖基转移酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了肠道微生物来源的岩藻糖基转移酶及其应用，属于合成生物学和基因工程技术领域。本发明专利技术提供了从肠道微生物中筛选的具有α

【技术实现步骤摘要】
肠道微生物来源的岩藻糖基转移酶及其应用


[0001]本专利技术涉及肠道微生物来源的岩藻糖基转移酶及其应用，属于合成生物学和基因工程


技术介绍

[0002]母乳寡糖是只存在于母乳中的一种重要低聚糖，在促进婴儿肠道菌群生长、完善免疫系统功能，以及促进大脑发育等方面发挥着不可替代的作用。其中2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
FL)占母乳寡糖总量的30％，是占比最高的一种母乳寡糖。它可由L
‑
岩藻糖和乳糖通过岩藻糖基转移酶催化合成。
[0003]近年来，研究者已开始广泛地使用微生物发酵法生产2
’‑
FL，主要使用的宿主菌包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等。这些微生物的野生型基因组中已含有2
’‑
FL合成途径的多种酶，如甘露糖变位酶、甘露糖
‑1‑
磷酸
‑
鸟苷酸转移酶等，然而均没有岩藻糖基转移酶。目前在2
’‑
FL重组菌株构建中应用最为广泛的岩藻糖基转移酶基因是幽门螺杆菌来源的futC和大肠杆菌O126来源的wbgL。虽然已有研究利用以上两种微生物来源的岩藻糖基转移酶构建获得了可以生产2
’‑
FL的重组菌，但是futC和wbgL编码的岩藻糖基转移酶在40℃以上的温度条件下催化效率极低。由于工业微生物的高温发酵对于降低染菌风险，提高发酵效率和降低发酵成本均十分有利，因此，挖掘与筛选催化效率高，且最适催化温度与细菌高温发酵条件相匹配的岩藻糖基转移酶，在2
’‑
FL的发酵生产等应用中具有很大的潜力。
[0004]肠道微生物是与母乳寡糖具有重要相互作用的一类微生物，它们所产生酶所介导的水解或转糖基反应可以改变母乳寡糖的结构。因此，肠道微生物有可能成为新型糖基转移酶的来源。然而，肠道微生物大多难以在体外的标准条件下进行纯培养及分离，阻碍了肠道微生物来源的催化效率高且耐高温的岩藻糖基转移酶的筛选。

技术实现思路

[0005]针对上述缺乏一种催化效率高、耐高温的岩藻糖基转移酶，且难以筛选的技术问题，本专利技术的目的在于利用宏基因组学技术，提供肠道微生物来源的催化活力高、且最适催化温度与细菌高温发酵所匹配的岩藻糖基转移酶及其编码基因。经过对携带了该基因的重组微生物发酵及代谢产物检测发现所筛选出的新酶可以在42℃的条件下高效合成2
’‑
FL，从而在母乳寡糖的发酵生产等应用中具有很大的潜力。
[0006]本专利技术提供一种肠道微生物来源的具有
ɑ
‑
1,2特异性的岩藻糖基转移酶，所述岩藻糖基转移酶的氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示，命名为HM26。
[0007]本专利技术提供一种肠道微生物来源的具有
ɑ
‑
1,2特异性的岩藻糖基转移酶的编码基因，所述岩藻糖基转移酶的编码基因是从肠道宏基因组中筛选获得；其核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示，分别编码HM26；
[0008]本专利技术提出的表达岩藻糖基转移酶的重组菌，以细菌或酵母为宿主，表达上述岩
藻糖基转移酶。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主为地衣芽孢杆菌。
[0010]本专利技术提出的表达岩藻糖基转移酶HM26的重组菌BLN2的构建方法，包含以下步骤：
[0011]通过同源重组将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示P
Lan
启动子和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示木糖异构酶基因的终止子ter分别与SEQ ID NO.5所示磷酸甘露糖变位酶基因manB、SEQ ID NO.6所示甘露糖
‑1‑
磷酸
‑
鸟苷酸转移酶基因manC、SEQ ID NO.7所示GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶基因gmd、SEQ ID NO.8所示GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶基因wcaG以及岩藻糖基转移酶HM26基因融合，获得基因表达片段H1、H2、H3、H4与N5；
[0012]分别使用引物对扩增基因表达片段H1、H2、H3、H4与N5，从而在基因片段两端引入酶切位点。依次利用同源重组的方法将基因表达片段H1、H2、H3连接入pHY300PLK质粒，得到重组质粒pHY
‑
H123。再依次利用同源重组的方法将基因表达片段H4和N5连接入pHT43质粒，得到重组质粒pHT
‑
N45。利用1％琼脂糖凝胶电泳进一步验证质粒的构建情况；
[0013]将成功构建的重组质粒pHYH123转化地衣芽孢杆菌ATCC 9945A，获得地衣芽孢杆菌工程菌BLH1，再将重组质粒pHT
‑
N45以上述相同的方法转化地衣芽孢杆菌工程菌BLH1，获得重组地衣芽孢杆菌菌BLN2；
[0014]本专利技术提出的表达岩藻糖基转移酶的重组菌生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的方法，将上述重组菌在LB平板上划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r
·
min
‑1培养16h
‑
18h作为种子液，取1mL种子液转接于30mL的摇瓶发酵培养基进行摇瓶发酵，控制初始OD为0.5
‑
1，于37℃或42℃、250r
·
min
‑1培养；
[0015]或将上述重组菌于发酵温度42℃、初始pH7.5的条件下在发酵罐中进行补料分批发酵。当发酵过程中pH下降到7.0时通过补加50％氨水使得发酵过程中pH维持在7.0左右，发酵过程中通气量控制在0.5vvm，将搅拌与DO偶联控制DO维持在30％左右，转速上限设置为800rpm。发酵8h后连续补加蔗糖，维持其不被耗尽。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，提出了肠道宏基因组来源的岩藻糖基转移酶与表达岩藻糖基转移酶的重组菌在生产2'
‑
FL发酵生产中的应用。
[0017]有益效果
[0018]本专利技术的有益效果在于：
[0019](1)本专利技术提供了一种肠道微生物来源的新型岩藻糖基转移酶HM26，其催化效率高，且在高温发酵(42℃)下仍具有较好的催化功能，在工业应用中有助于降低染菌风险，提高发酵效率和降低发酵成本。
[0020](2)本专利技术构建了表达岩藻糖基转移酶HM26的地衣芽孢杆菌重组菌BLN2，在42℃培养条件下，重组菌BLN2摇瓶发酵36h后可以得到2.85g/L的2
’‑
FL；重组菌BLN2在30L发酵罐补料分批发酵46h后2
’‑
FL的产量达到51g/L，最大OD
600
为73.5。
附图说明
[0021]图1：重组质粒pHY
‑
H123质粒图谱。
[0022]图2：重组质粒pHT
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种岩藻糖基转移酶，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述岩藻糖基转移酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种表达岩藻糖基转移酶的重组菌，其特征在于，以细菌或酵母为宿主，表达权利要求1所述的岩藻糖基转移酶。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述宿主为地衣芽孢杆菌。5.一种构建权利要求3或4所述重组菌的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)在磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖
‑1‑
磷酸
‑
鸟苷酸转移酶基因manC、GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶基因gmd、GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶基因wcaG以及岩藻糖基转移酶基因的两端分别融合SEQ ID NO.3所示的启动子和SEQ ID NO.4所示的终止子，获得含上述基因的表达片段；(2)将步骤(1)构建的表达片段以manB、manC与gmd的顺序连接至质粒pHY300PLK上，得到重组质粒1；再将基因wcaG与权利要求2所述基因连接至质粒pHT43，得到重组质粒2；(3)将步骤(2)构建的重组质粒1、重组质粒2转化至地衣芽孢杆菌，获得重...

【专利技术属性】
技术研发人员：李由然，石贵阳，吴志勇，陈权，
申请(专利权)人：无锡特殊食品与营养健康研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：