本发明专利技术提供一种细胞增殖免疫荧光检测试剂盒及其应用。本发明专利技术在现有核酸荧光标记方法的基础上，通过引入M期细胞特殊标记(磷酸化组蛋白H3)以有效区分G2和M期细胞。通过甄选优化实验基础条件，使基础核酸标记物，新合成核酸标记物，以及M期细胞特殊标记能够兼容，从而完成对四个细胞周期的全面检测。进一步结合免疫荧光细胞术定性或定量观测不同细胞增殖周期细胞的亚细胞结构，从而能够准确反映出细胞增殖周期的全部信息。本发明专利技术提供的细胞周期检测方法具有操作简单、高效、敏感，试剂廉价易得等优点，可以对细胞样本进行定性，定量和定位检测，应用前景广阔。应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
细胞增殖免疫荧光检测试剂盒及其应用
[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种细胞增殖免疫荧光检测试剂盒及其应用。
技术介绍
[0002]细胞增殖是维持生命的基础，是一个非常复杂精密调控的生理过程。根据增殖过程中的核酸，蛋白质及细胞整体变化特征，细胞的增殖周期可以人为分成G1,S,G2和M四个周期。
[0003]很多遗传病，感染性疾病以及肿瘤等疾病发生发展都和细胞的增殖周期异常直接相关，因此细胞增殖周期的检测是判断细胞病理机制的重要手段，也是临床和基础生物医学科研中常用的实验方法。
[0004]免疫荧光术结合荧光显微镜及自动数据处理系统，可以定性或定量观测不同周期细胞的数量、比例、亚细胞结构及相关蛋白的表达分布等，是生物医学领域最常用的技术手段之一。
[0005]目前国内外细胞增殖周期的检测方法主要有两类，第一类是直接用核酸试剂(如PI,DAPI,HOECHST等)染细胞DNA，通过观测不同细胞周期细胞DNA荧光含量不同而对细胞周期进行分析。此方法非常简单，易操作；但是实验结果分析很困难，容易产生诸多误差，尤其是对S和M期细胞的分析很不可靠。目前只适合于结合流式细胞术做一些药物初筛。
[0006]第二类是在第一类核酸试剂的基础上，另外用核苷酸类似物(如EdU)标记新合成的DNA，以用于区分S期细胞。由于S期细胞可以被标记信号放大显示，所以此方法可以将细胞分成G1,S和G2M三个周期。此方法可以用于研究一些影响G1/S,S/G2周期的病理过程，但是对G2/M周期却没有办法检测。不仅无法提供细胞增殖周期全部信息，而且对G2/M周期过渡有影响的疾病完全不能检验。因此，亟需建立一种用于有效区分鉴别M和G2期细胞结构的方法。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的是提供一种细胞增殖免疫荧光检测试剂盒及其应用。
[0008]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供磷酸化组蛋白H3作为细胞增殖周期中M期标志物中的应用。
[0009]第二方面，本专利技术提供检测磷酸化组蛋白H3的试剂在制备用于区分细胞增殖周期中M期的检测试剂中的应用。
[0010]前述的应用，所述检测磷酸化组蛋白H3的试剂为抗磷酸化组蛋白H3抗体，如抗人p
‑
H3
‑
Alexa Fluro647抗体(Abcam,ab237418)。
[0011]第三方面，本专利技术提供一种细胞增殖免疫荧光检测试剂盒(细胞周期荧光检测试剂盒)，所述试剂盒包含磷酸化组蛋白H3抗体。
[0012]进一步地，所述试剂盒还包含新合成DNA标记物、细胞固定剂、破膜剂和总核酸荧
光染色剂等中的至少一种。
[0013]所述新合成DNA标记物可以是Edu(5
‑
乙炔基
‑2‑
脱氧尿苷，为胸腺嘧啶替代物)。
[0014]所述细胞固定剂可以是1
‑
4％(优选2％)多聚甲醛。其配置方法如下：将粉剂多聚甲醛溶于双蒸水中，以配制质量比40％母液。加热搅拌并滴加NaOH至粉剂完全溶解，
‑
20℃冻存母液。使用时取母液溶解，用PBS稀释母液至1
‑
4v/v％工作液。
[0015]所述破膜剂可以是含0.1
‑
1％(优选0.1％)Triton的PBS。
[0016]所述荧光染色剂可以是DAPI。
[0017]第四方面，本专利技术提供所述试剂盒在检测细胞增殖周期M期中的应用(含非疾病诊断和治疗目的)。
[0018]第五方面，本专利技术提供一种检测细胞增殖周期M期的方法(含非疾病诊断和治疗目的)，包括以下步骤：
[0019](1)将细胞置于含1
‑
10μM Edu的细胞完全培养基中培养0.5
‑
4小时；
[0020](2)培养结束后，将细胞用PBS洗涤2
‑
3次后，用2％多聚甲醛室温下固定细胞20分钟后，用洗涤液(含10％FCS的PBS)清洗细胞(去除固定液)；
[0021](3)用破膜剂(含0.1v/v％Triton的PBS)室温下处理细胞20分钟后，用洗涤液清洗细胞(去除破膜剂)；
[0022](4)用Edu标记溶剂(含有1mM CuSO4、0.1μM azide
‑
Alexa Fluro 488和100mM抗坏血酸的100mM Tris溶液)重悬细胞，室温下处理细胞20分钟后，用洗涤液清洗细胞(去除多余试剂)；
[0023](5)加入10μg/ml p
‑
H3
‑
Alexa Fluro647重悬细胞，4℃染色细胞30分钟后，用洗涤液清洗细胞(去除多余抗体)；
[0024](6)用PBS将细胞调整到合适浓度，将细胞悬液甩片到载玻片上；
[0025](7)用1μg/ml DAPI室温下染色10分钟后，用PBS洗涤4
‑
5次；
[0026](8)滴加上样缓冲液(90v/v％甘油+10v/v％pH9的PBS)，加上盖玻片，并封片；
[0027](9)将细胞样本在荧光显微镜下观察。
[0028]如果实验对象为贴壁细胞，则需要将步骤(6)去除，并在步骤(2)中将细胞直接培养到载玻片上。
[0029]所述细胞为哺乳动物体细胞，优选灵长类动物体细胞，更优选人类体细胞。
[0030]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0031]为了突破传统细胞增殖周期检测技术的局限，本专利技术提供一种新型的细胞周期荧光检测试剂盒。本专利技术在现有核酸荧光标记方法的基础上，通过引入M期细胞特殊标记(磷酸化组蛋白H3)以有效区分G2和M期细胞。通过甄选优化实验基础条件，使基础核酸标记物，新合成核酸标记物，以及M期细胞特殊标记能够兼容，从而完成对四个细胞周期的全面检测。进一步结合免疫荧光细胞术定性或定量观测不同细胞增殖周期细胞的亚细胞结构，从而能够准确反映出细胞增殖周期的全部信息。本专利技术提供的细胞周期检测方法具有操作简单、高效、敏感，试剂廉价易得等优点，可以对细胞样本进行定性，定量和定位检测，应用前景广阔。
附图说明
[0032]图1为本专利技术较佳实施例中利用细胞周期荧光检测试剂盒对K562细胞增殖周期的检测结果。
[0033]图2为本专利技术较佳实施例中染色后的细胞用流式细胞术检测验证结果。
[0034]图3为本专利技术较佳实施例中固定剂破膜剂筛选优化实验结果；其中，A：2％多聚甲醛及saponin(皂素)；B：2％多聚甲醛及含0.1v/v％Triton的PBS；C：低温乙醇；D：商用试剂盒(ThermoFisher Scientific，货号A10266)。
[0035]图4为本专利技术较佳实施例中p
‑
H3
‑
Alexa Fluro647抗体优选实验结果；其中，A：pS28
‑
H3...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.磷酸化组蛋白H3作为细胞增殖周期中M期标志物中的应用。2.检测磷酸化组蛋白H3的试剂在制备用于区分细胞增殖周期中M期的检测试剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测磷酸化组蛋白H3的试剂为抗磷酸化组蛋白H3抗体。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测磷酸化组蛋白H3的试剂为抗人p
‑
H3
‑
Alexa Fluro647抗体。5.细胞增殖免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含磷酸化组蛋白H3抗体。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含新合成DNA标记物、细胞固定剂、破膜剂和核酸荧光染色剂中的至少一种。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸化组蛋白H3抗体为抗人p
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H3
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Alexa Fluro647抗体；和/或所述新合成DNA标记物为Edu；和/或所述细胞固定剂为1
‑
4％多聚甲醛；和/或所述破膜剂为含0.1
‑
1v/v％Triton的PBS；和/或所述核酸荧光染色剂为DAPI。8.权利要求5
‑
7任一项所述试剂盒在检测细胞增殖周期M期中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的。9.检测细胞增殖周期M期的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将细胞置于含1...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊仕秋，
申请(专利权)人：武汉市鼎华双雄生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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