一种过表达突变TDP-35的NSC-34细胞模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种过表达突变TDP

【技术实现步骤摘要】
一种过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞模型的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞模型的构建方法。

技术介绍

[0002]肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)，是选择性地损害运动神经元的慢性进行性变性疾病。其中5～10％的ALS是家族性ALS,90％ALS是散发性ALS。大约20％的家族性ALS和3％的散发性ALS与超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突变有关。最近，在ALS患者的运动神经元和胶质细胞的胞核和胞浆中均发现了异常泛素化的蛋白聚集体，主要成分是43kDa的TAR DNA结合蛋白(TDP
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43)。并且，TDP
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43及其形成的片段TDP
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35在ALS的病理过程中发挥重要作用，但具体机制尚不清楚。自噬(autophagy)是高度保守的细胞生物学行为，其分子机制从酵母细胞到哺乳动物细胞十分相似。在自噬过程中，待降解的胞浆组分及细胞器被包裹在具有双层膜结构自噬小体中，最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体，实现胞内物质的降解，从而维持细胞自稳。在中枢神经系统，自噬已成为了清除错误折叠蛋白的重要途径，并对神经元正常功能的维持很必要。在一些神经变性疾病中,其病理机制与细胞内蛋白的异常聚积并形成聚集体和包涵体有关，最近发现Alfy与某些泛素化蛋白聚集体的自噬降解有关。Alfy(Autophagy
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linked FYVE protein)是一个400KD的蛋白，在哺乳动物组织中普遍存在，脑中含量最多。在正常情况下主要分布于核和核膜，在应激状态，可被募集到胞浆泛素阳性蛋白聚集体。已有研究表明Alfy对PD和HD病相关的胞浆聚集蛋白的自噬降解是必需的。在HD神经元模型中过表达ALFY能促进polyQ聚集体的清除。本课题目的是研究在过表达TDP
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35的NSC
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34细胞中，Alfy能否促进聚集蛋白的清除，并进一步探讨其降解聚集蛋白的机制；明确Alfy对突变TDP
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43的片段TDP
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35的降解机制会为我们最终在临床治疗中调控ALS相关毒性蛋白质的降解、治疗ALS疾病提供有用的基础科研数据。
[0003]ALS是以运动神经元渐进性变性为主的慢性进展性的神经变性疾病，最终导致瘫痪和死亡。目前学术界认为突变TDP
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43是除SOD1以外的一种ALS致病蛋白质。编码TDP
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43蛋白质的TARDBP基因突变与大约3％的SOD1家族性病例和1.5％散发性病例有关，这是继1993年SOD1突变致病性的又一大重大发现。TDP
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43的片段TDP
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35在ALS发病中作用机制及其降解机制成为了近期神经变性病领域的关注热点。有研究表明：促进相关蛋白质可以减轻神经变性病的毒性蛋白质聚集，延缓变性疾病的进程。目前国内外尚没有对Alfy能否促进ALS相关聚集蛋白的清除及其降解机制的研究报道。明确Alfy对突变TDP
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43的片段TDP
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35的降解机制、判断促蛋白降解能否对运动神经元生存状态带来益处是ALS研究领域亟待解决的问题，可为今后ALS的临床治疗的相关研究提供重要参考数据。

技术实现思路

[0004]针对上述的技术问题，本专利技术提供了一种过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞模型的构建方法。
[0005]为了达到上述技术效果，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
[0007]S1：构建过表达突变TDP
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35基因的质粒；
[0008]S2：将步骤S1所得的过表达突变TDP
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35基因的质粒转染至NSC
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34细胞中；
[0009]S3：筛选过表达突变TDP
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35的NSC
‑
34细胞；
[0010]S4：对过表达突变TDP
‑
35的NSC
‑
34细胞进行功能研究。
[0011]进一步的，所述步骤S1包括以下子步骤：
[0012]S1.1：设计质粒，通过Bioinformatic软件设计合成过表达突变TDP
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35基因的质粒；
[0013]S1.2：PCR扩增TDP
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35基因的DNA序列，从TDP
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35基因的DNA序列中设计引物进行PCR扩增，将TDP
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35基因克隆到表达载体上进行后续实验；
[0014]S1.3：克隆到表达载体上，将PCR扩增产品与表达载体酶切后进行连接，将TDP
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35基因克隆到表达载体上；
[0015]S1.4：突变质粒，通过定向突变或点突变技术对克隆后的表达载体进行突变操作；
[0016]S1.5：质粒鉴定和测序，通过限制性酶切和测序的实验手段，对构建后的质粒进行鉴定和测序，确保质粒构建的正确性；确定用于转染细胞的正确可行的质粒。
[0017]进一步的，所述步骤S1.2中PCR反应具体包括：模板DNA数量：100ng；引物浓度：0.2μM；Taq；酶浓度：0.06U/μl；dNTP浓度：0.2mM；PCR反应体系总体积为50μl；PCR反应条件为94℃预变性5min，96℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
[0018]进一步的，所述步骤S1.3中酶切反应具体包括：模板DNA数量：1μg；酶切缓冲液2μl、酶2μl、模板DNA10μg、水至总体积20μl；酶切温度和切位及时间根据实验室酶切的习惯和酶切位点的不同而有所不同，具体温度和时间需按照酶的厂商说明进行设置。
[0019]进一步的，所述步骤S1.4中定向突变具体包括：将合成的DOP
‑
PCR产品与克隆好的表达载体进行配对突变；点突变：通过Site
‑
Directed Mutagenesis Kit工具进行点突变。
[0020]进一步的，所述步骤S2包括以下子步骤：
[0021]S2.1：细胞培养，在96孔板中培养NSC
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34细胞，需要接种2万个细胞至每个孔中，每个孔需添加200μl培养液；在37℃、5％CO2的环境下培养；
[0022]S2.2：转染实验，转染方法可以选择瞬时转染、磷酸钙法、脂质体法、电穿孔法、基因枪法；其中瞬时转染的具体操作步骤包括：在细胞培养皿中预先培养NSC
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34本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：构建过表达突变TDP
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35基因的质粒；S2：将步骤S1所得的过表达突变TDP
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35基因的质粒转染至NSC
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34细胞中；S3：筛选过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞；S4：对过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞进行功能研究。2.如权利要求1所述的一种过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下子步骤：S1.1：设计质粒，通过Bioinformatic软件设计合成过表达突变TDP
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35基因的质粒；S1.2：PCR扩增TDP
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35基因的DNA序列，从TDP
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35基因的DNA序列中设计引物进行PCR扩增，将TDP
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35基因克隆到表达载体上进行后续实验；S1.3：克隆到表达载体上，将PCR扩增产品与表达载体酶切后进行连接，将TDP
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35基因克隆到表达载体上；S1.4：突变质粒，通过定向突变或点突变技术对克隆后的表达载体进行突变操作；S1.5：质粒鉴定和测序，通过限制性酶切和测序的实验手段，对构建后的质粒进行鉴定和测序，确保质粒构建的正确性；确定用于转染细胞的正确可行的质粒。3.如权利要求2所述的一种过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤S1.2中PCR反应具体包括：模板DNA数量：100ng；引物浓度：0.2μM；Taq；酶浓度：0.06U/μl；dNTP浓度：0.2mM；PCR反应体系总体积为50μl；PCR反应条件为94℃预变性5min，96℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。4.如权利要求2所述的一种过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤S1.3中酶切反应具体包括：模板DNA数量：1μg；酶切缓冲液2μl、酶2μl、模板DNA10μg、水至总体积20μl；酶切温度和切位及时间根据实验室酶切的习惯和酶切位点的不同而有所不同，具体温度和时间需按照酶的厂商说明进行设置。5.如权利要求2所述的一种过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤S1.4中定向突变具体包括：将合成的DOP
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PCR产品与克隆好的表达载体进行配对突变；点突变：通过Site
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DirectedMutagenesisKit工具进行点突变。6.如权利要求1所述的一种过表达突变TDP
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35的NSC
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34细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤S2包括以下子步骤：S2.1：细胞培养，在96孔板中培养NSC
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34细胞，需要接种2万个细胞至每个孔中，每个孔需添加200μl培养液；在37℃、5％CO2的环境下培养；S2.2：转染实验，转染方法可以选择瞬时转染、磷酸钙法、脂质体法、电穿孔法、基因枪...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩惠慧，陈荣，刘亚坤，洪坤，李奕，刘畅，赵彤，赵秀敏，杨静棉，
申请(专利权)人：河北医科大学第二医院，
类型：发明
国别省市：