本发明专利技术公开了一种三叶斑潜蝇(Liriomyza trifolii)的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还公开了一种基于环境DNA检测植物叶片中三叶斑潜蝇(Liriomyza trifolii)为害的方法，包括以下步骤：将含有昆虫潜道的植物叶片进行DNA提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测，当检测结果为有电泳条带且条带位置为750bp时，表明有三叶斑潜蝇为害；否则为没有三叶斑潜蝇为害。本发明专利技术涉及的三叶斑潜蝇环境DNA检测方法能够在潜道中检测到三叶斑潜蝇为害的发生，确定了检测到时间阈值和检测方法，这将在斑潜蝇鉴定及田间预警监测应用中具有重要的意义。预警监测应用中具有重要的意义。预警监测应用中具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
一种基于环境DNA检测植物叶片中三叶斑潜蝇为害的方法
[0001]本专利技术涉及一种基于环境DNA检测植物病虫为害的方法，尤其涉及一种基于环境DNA检测植物叶片中三叶斑潜蝇(Liriomyza trifolii)为害的方法，属于生物
技术介绍
[0002]三叶斑潜蝇Liriomyza trifolii(Burgess)隶属双翅目Diptera、潜蝇科Agromyzidae、斑潜蝇属Liriomyza，是一种园艺蔬菜上危害严重的世界性害虫，同时也是我国重要的外来入侵有害生物(Spencer，1973，Wan&Yang，2016)。近些年随着设施农业的发展，三叶斑潜蝇类的害虫危害严重趋势愈显，如今已经逐渐成为园艺及蔬菜生产上的重要害虫。三叶斑潜蝇由于体型小，近缘种(如美洲斑潜蝇L.sativae Blanchard、南美斑潜蝇L.huidobrenis Blanchard等)形态学相似，生育期短，鉴定及田间调查监测困难。此外，实际田间调查过程中，由于其幼虫具有落土化蛹习性，通常发现潜道，这对预警监测带来挑战，急需一种快速高效的检测方法。
[0003]环境DNA(eDNA)指生物体遗留在周围环境中的遗传物质，可以是多种来源的线粒体或核DNA，包括脱落的肠道和皮肤细胞、粪便、体液等，它允许我们在不直接观察或捕获整个生物体的情况下检测物种的存在或最近的存在。近年来，兴起的基于昆虫遗留在环境中的DNA的定量检测技术实现了物种检测中的高特异性和高效性的统一。但由于各类昆虫eDNA的释放量和富集难易程度不一样，目前大多专利技术应用在水生生境中，鲜有基于环境DNA技术的农业害虫检测方面的专利技术，而斑潜蝇在叶片中危害的独特习性也提高了开展环境DNA检测的可能。
技术实现思路
[0004]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种三叶斑潜蝇的特异性引物对。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题是一种基于环境DNA检测植物叶片中三叶斑潜蝇为害的方法。
[0006]技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术提供了三叶斑潜蝇(Liriomyza trifolii)的特异性引物对，所述三叶斑潜蝇的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术还提供了一种基于环境DNA检测植物叶片中三叶斑潜蝇(Liriomyza trifolii)为害的方法，包括以下步骤：
[0008](1)将含有昆虫潜道的植物叶片进行DNA提取；
[0009](2)用所述特异性引物对对步骤(1)中所述的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0010](3)将步骤(2)中所述的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
[0011](4)当步骤(3)中所述的琼脂糖凝胶电泳检测结果为有电泳条带且条带位置为750bp时，表明有三叶斑潜蝇为害；当步骤(3)中所述的琼脂糖凝胶电泳检测结果为没有电泳条带或者电泳条带位置没有到达750bp时，表明没有三叶斑潜蝇为害。
[0012]其中，步骤(1)中所述的植物包括豇豆、番茄、黄瓜或丝瓜中的一种或几种。
[0013]其中，步骤(1)中所述昆虫潜道的时长为0～14天，本专利技术所述昆虫潜道的时长为昆虫离开潜道的时长。
[0014]其中，步骤(2)中所述PCR扩增反应体系为：Taq master Mix、ddH2O、特异性引物对、模板DNA。
[0015]其中，步骤(2)中所述PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环，最后72℃延伸10分钟。
[0016]其中，当所述昆虫潜道的的时长为0天时，所述昆虫潜道长为10.11
‑
10.4mm；宽为0.21
‑
0.36mm。
[0017]其中，当所述昆虫潜道的时长为7天时，所述昆虫潜道长为30.17
‑
31.12mm，宽为1.38
‑
1.42mm。
[0018]其中，当所述昆虫潜道的时长为14天时，所述昆虫潜道长为31.3
‑
31.74mm，宽为1.43
‑
1.47mm。
[0019]其中，步骤(1)中所述昆虫潜道的时长为0～7天。
[0020]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：本专利技术涉及的三叶斑潜蝇环境DNA检测方法能够在潜道中检测到三叶斑潜蝇为害的发生，确定了检测到时间阈值和检测方法，这将在斑潜蝇鉴定及田间预警监测应用中具有重要的意义。
附图说明
[0021]图1为本专利技术的操作步骤；
[0022]图2为三叶斑潜蝇为害后不同时长下的豇豆叶片潜道图；
[0023]图3为不同时长下的豇豆叶片潜道DNA的PCR结果图；
[0024]图4为不同时长下的番茄叶片潜道DNA的PCR结果图；
[0025]图5为不同时长下的黄瓜叶片潜道DNA的PCR结果图；
[0026]图6为不同时长下的丝瓜叶片潜道DNA的PCR结果图。
具体实施方式
[0027]下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0028]实施例1
[0029]一种基于环境DNA检测豇豆潜道叶片中三叶斑潜蝇为害的方法，其步骤如图1所示，具体步骤如下：
[0030]1、潜道DNA提取：
[0031](1)让三叶斑潜蝇幼虫在豇豆叶片中室温生长(三叶斑潜蝇幼虫由扬州大学实验室饲养)，收集如图2所示的豇豆叶片，即分别在三叶斑潜蝇幼虫离开潜道时、离开潜道7天时和离开潜道14天时立即收集豇豆叶片，收集得到分别含有时长为0、7、14天的潜道的豇豆叶片(本实施例中时长为0天的潜道长为10.11mm、宽为0.21mm，时长为7天的潜道长为30.17mm、宽为1.38mm，时长为14天的潜道长为31.3mm、宽为1.43mm)，然后将完整的潜道剪下来放到1.5mL的离心管中。
[0032](2)DNA提取：采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的DNA小量试剂盒(DC102)并
按照说明书要求进行DNA提取。该方法操作简单、快速、高效且无毒，提取的DNA的质量符合本研究的需要，具体步骤如下：将包含潜道叶片的离心管放入液氮中30秒后取出，移入玻璃匀浆器，加入100μL的Buffer GA和20μL的蛋白酶K研磨2分钟，再使用130μL的Buffer GA冲洗；将匀浆器中所有溶液收集至新的1.5mL离心管中，55℃水浴10分钟后，12000rpm离心3分钟，转移上清液至新的1.5mL离心管；加入250uL Buffer GB后以2800次/分的速率涡旋均匀20秒，70℃水浴10分钟；加入180μL无水乙醇，2800次/分涡旋混匀30秒，将混合液加入离心柱中，12000rpm离心1分钟；弃滤液，在离心柱中加入500μL的Washing Buffer A，12000rpm离心1分钟；弃滤液，在离心柱中加入650μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种三叶斑潜蝇(Liriomyza trifolii)的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。2.一种基于环境DNA检测植物叶片中三叶斑潜蝇(Liriomyza trifolii)为害的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将含有昆虫潜道的植物叶片进行DNA提取；(2)用权利要求1所述特异性引物对对步骤(1)中所述的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(3)将步骤(2)中所述的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；(4)当步骤(3)中所述的琼脂糖凝胶电泳检测结果为有电泳条带且条带位置为750bp时，表明有三叶斑潜蝇为害；当步骤(3)中所述的琼脂糖凝胶电泳检测结果为没有电泳条带或者电泳条带位置没有到达750bp时，表明没有三叶斑潜蝇为害。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的植物包括豇豆、番茄、黄瓜或丝瓜中的一种或几种。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的昆虫潜道的时长为0～14天。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述P...
【专利技术属性】
技术研发人员：常亚文，王玉淳，王禹程，谢洪芳，龚伟荣，杜予州，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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