适用于PBMC的冻干保护液及冻干方法技术

本发明专利技术公开了适用于PBMC的冻干保护液及冻干方法，保护液包括：缓冲液，以及PBS缓冲液中还添加有，以质量分数计：5

【技术实现步骤摘要】
适用于PBMC的冻干保护液及冻干方法


[0001]本专利技术是关于生物技术，特别是关于一种适用于PBMC的冻干保护液及冻干方法。

技术介绍

[0002]冷冻干燥(Freeze Drying)又称升华干燥，其是将湿物料或溶液在较低的温度(
‑
10℃～
‑
50℃)下冻结成固态，然后在真空(1.3～13Pa)下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术。在整个过程中物料可先在冷冻装置内冷冻，再进行干燥，也可直接在干燥室内迅速抽成真空而冷冻，升华生成的水蒸气借冷凝器除去，升华过程中所需的汽化热量，一般用热辐射供给。中国是原料药生产大国，因此该技术应用前景十分广阔。冷冻干燥主要优点是：干燥的过程中不受表面张力的作用，样品不变形；由于隔绝了空气，因此有效地抑制了热敏性物质发生生物、化学或物理变化，并较好地保存了原料中的活性物质，以及保持了原料的色泽，干燥后的样本十分稳定，便于长时间储存；在真空冷冻干燥过程中，物料不存在表面硬化问题，且其内部形成多孔的海绵状，因而具有优异的复水性，可在短时间内恢复干燥前的状态；热量消耗比其他干燥方法少。
[0003]外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，其主要包括淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)，单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。免疫治疗中使用的CIK，DC
‑
CIK，NK，CAR
‑
T等免疫细胞都从PBMC中通过不同的方式诱导而来，在细胞免疫治疗领域具有重要的地位。然而新鲜分离的PBMC由于其细胞种类复杂，冻存和复苏过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。目前，细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂(实验证明二甲基亚砜更好)，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。影响冻存复苏活率的因素很多，如冻存前的细胞质量，冻存细胞浓度，冻存液的种类，冻存中的温度控制，冻存复苏时的实验操作等都会影响冻存复苏活率。新鲜复苏的PBMC细胞的冻存复苏活率一般都在90％以上，但是24h之内会有细胞出现凋亡，因此，细胞的冻存复苏活率，很大程度上取决于细胞复苏后的24h之内的状况。细胞冻存的方法在现有技术中采用最多的是利用程序性降温盒置于超低温冰箱中放置24～72h，再转移至液氮中进行长期的保存。但程序性降温盒在逐渐降温的过程中无法精确控制降温速率，会导致冻存液中形成较多的冰晶，导致细胞受到较大的损伤，实验中经常发现PBMC冻存后，稍有不慎细胞就会大量死亡，无法进行后续实验(如细胞培养，染色等)；同时细胞保存也要长期置于液氮中，在运输及保存过程也给科研工作者带来极大的不便。目前常用保存PBMC的方法是液氮冻存，该方法对于冻存的要求较高，虽然在短时间内能够保证细胞的活性，但长时间保存细胞完整性无法保证。研究表明，PBMC在冻存过程中，大量的细胞会因为细胞破碎而没有细胞形态，最后仅留存少量的细胞而无法进
行流式细胞术、免疫荧光、细胞计数等多种实验场景。冻存过程中，需要长期将细胞置于液氮罐中，需要足量的液氮，所以需要时刻关注液氮情况，稍有不慎，细胞就会因为没有液氮急剧升温而破碎，同时也增加冻存成本。与此同时，冻存细胞也无法进行长距离和长时间的运输和保存。
[0004]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种适用于PBMC的冻干保护液及冻干方法，具有良好的应用便利性，可以良好地保持细胞的完整性和生物活性，可在4℃和室温中长期运输和保存，也节约了大量的人力和物力。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的实施例提供了适用于PBMC的冻干保护液，包括：缓冲液，以及缓冲液中还包括，以质量分数计：5
‑
27％细胞保护剂；1
‑
2％BSA。
[0007]在本专利技术的一个或多个实施方式中，缓冲液选自PBS缓冲液。
[0008]在本专利技术的一个或多个实施方式中，细胞保护剂包括，以质量分数计5
‑
10％第一试剂，第一试剂选自DMSO、甘油。
[0009]在本专利技术的一个或多个实施方式中，细胞保护剂还包括，以质量分数计1
‑
2％第二试剂，第二试剂选自海藻糖
、
蔗糖。
[0010]在本专利技术的一个或多个实施方式中，细胞保护剂还包括，以质量分数计10
‑
15％PVP360。
[0011]在本专利技术的一个或多个实施方式中，保护液包括：PBS缓冲液，以及PBS缓冲液中还添加有，以质量分数计：5
‑
10％DMSO；1
‑
2％海藻糖；10
‑
15％PVP360；1
‑
2％BSA。
[0012]在本专利技术的一个或多个实施方式中，保护液包括：PBS缓冲液，以及PBS缓冲液中还添加有，以质量分数计：10％DMSO；2％海藻糖；15％PVP360；2％BSA。
[0013]在本专利技术的一个或多个实施方式中，应用如前述的适用于PBMC的冻干保护液的冻干方法，包括如下步骤：准备保护液并过滤备用；准备PBMC细胞；以保护液重悬PBMC细胞，并充分混匀后转移至冻存管中，再冷冻、真空干燥，即得到冻干细胞。
[0014]在本专利技术的一个或多个实施方式中，冷冻的条件为：
‑
80℃～
‑
75℃下冷冻12
‑
24h。
[0015]在本专利技术的一个或多个实施方式中，真空干燥为：
‑
60℃～
‑
65℃条件下真空(0.01
‑
0.1bar)冷冻干燥16
‑
20h。
[0016]与现有技术相比，根据本专利技术实施方式的适用于PBMC的冻干保护液及冻干方法，为有效的进行流式细胞术、免疫荧光、细胞计数等多种应用场景提供了便利，在针对性开发的保护体系下采用冷冻干燥的方法对PBMC细胞进行冻干，保证细胞完整性的同时可以进行抗体染色或其它后续实验，同时冻干细胞可在4℃和室温中长期运输和保存，也节约了大量的人力和物力。
具体实施方式
[0017]下面结合本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0018]除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于PBMC的冻干保护液，包括：缓冲液，所述缓冲液还添加有，以质量分数计：5
‑
30％细胞保护剂；1
‑
2％BSA。2.如权利要求1所述的适用于PBMC的冻干保护液，其特征在于，所述缓冲液选自PBS缓冲液。3.如权利要求1所述的适用于PBMC的冻干保护液，其特征在于，所述细胞保护剂包括，以质量分数计5
‑
10％第一试剂，所述第一试剂选自DMSO、甘油。4.如权利要求3所述的适用于PBMC的冻干保护液，其特征在于，所述细胞保护剂还包括，以质量分数计1
‑
2％第二试剂，所述第二试剂选自海藻糖、蔗糖。5.如权利要求4所述的适用于PBMC的冻干保护液，其特征在于，所述细胞保护剂还包括，以质量分数计10
‑
15％PVP360。6.如权利要求1所述的适用于PBMC的冻干保护液，其特征在于，所述保护液包括：PBS缓冲液。所述PBS缓冲液中还添加有，以质量分数计：5
‑
10％DMSO；1
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜菁，王伟，彭靖元，章桂香，侯舒捷，
申请(专利权)人：江苏汇先医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：