基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器及其制备方法和应用，该传感器在电极上修饰具有各向异性的Pd

【技术实现步骤摘要】
基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物电化学传感器
，具体涉及基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]外泌体（exosomes）是一种尺寸比较小的细胞外囊泡，大小在30
‑
150 nm左右，来源于多囊泡内体，并且在多囊泡体与质膜融合时被积极分泌。肿瘤微环境由癌细胞、成纤维细胞、内皮细胞和特定实质内的免疫细胞等多种细胞组成。已有研究表明，癌细胞可以通过释放纳米级细胞外囊泡即外泌体，以分泌方式影响肿瘤生态内的其他细胞，从而加速肿瘤块的生长，并且具有显著信息的外泌体可以反映亲本肿瘤细胞代谢和蛋白质组谱的任何变化。因此，可以通过检测外泌体的相关信息来预测肿瘤的发生。另外，外泌体的膜上有许多不同的膜蛋白，这些蛋白可以作为肿瘤产生和繁殖的标志物，因此，对肿瘤细胞来源的外泌体的分析检测在基础研究、临床诊断和分子治疗等多个方面具有重要的潜在应用价值。
[0003]外泌体可以利用抗体或核酸适配体的识别作用靶向表面蛋白质，结合多种方法如比色法、荧光法、表面增强拉曼法，但这些方法需要用到大型仪器，价格昂贵，耗时长。电化学方法具有仪器设备简单，价格低廉等优点，但灵敏度不高，为了提高检测的灵敏度，通常会进行一些信号扩增，常见的信号扩增主要为利用内切酶的循环扩增，酶聚合链反应，DNA的链式杂交或使用纳米材料作为载体负载更多的信号分子，但酶等生物分子的使用会提高造价且受环境的影响较大，容易失活。纳米材料如Au、Pd等贵金属材料具有很好的生物相容性和催化活性，但由于外泌体本身导电性差，会影响其催化活性，从而影响检测的灵敏度。因此如何更好的提高检测的灵敏度是实现外泌体有效检测急需解决的问题。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：针对现有技术存在的外泌体检测繁琐耗时、选择性差、灵敏度低、成本高等缺点，本专利技术提供了一种基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器，并建立一种基于等离子体共振（LSPR）检测肿瘤细胞外泌体的方法，能够快速、高效的检测检测到肿瘤细胞外泌体，而且灵敏度高、重现性好、操作简单、成本低廉。
[0005]本专利技术的另一目的是提供所述肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器的制备方法和应用。
[0006]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器，所述电化学传感器包括电极、具有各向异性的Pd
‑
Au异质结构纳米双锥、双适配体和核酸探针，所述具有各向异性的Pd
‑
Au异质结构纳米双锥修饰在电极表面，所述双适配体通过核酸探针固定在修饰了具有各向异性的Pd
‑
Au异质结构纳米双锥电极表面，其组成为dual
‑
aptamer/probe/PTA NBPs/电极。
[0007]其中，所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，所述双
适配体为含有可以特异性识别CCRF
‑
CEM肿瘤细胞中过表达的膜蛋白（PTK7）的适配体。
[0008]进一步地，所述双适配体为含有同一种的适配体的两种不同的DNA链，可以互相杂交形成双适配体，所述双适配体不限于可以特异性识别CCRF
‑
CEM肿瘤细胞中过表达的膜蛋白（PTK7）的适配体，不同双适配体序列，可以得到识别其他膜蛋白的双适配体。
[0009]其中，所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，所述核酸探针为可以与双适配体杂交的且可以固定在Pd
‑
Au异质结构纳米双锥上的DNA序列。
[0010]其中，所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，具有各向异性的Pd
‑
Au异质结构纳米双锥为具有表面等离子共振效应的双金属异质结构纳米材料。
[0011]其中，所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，所述电极为玻碳电极、金电极、铂电极、热解石墨电极或ITO电极中的任意一种。
[0012]本专利技术所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：（1）制备金种子将其加入到生长液中形成Au NBPs溶液，离心分散到CTAC溶液中，随后加入AgNO3和抗坏血酸混合均匀，将混合溶液油浴加热形成Au NBP@Ag纳米结构，再次离心后分散到CTAB溶液中，加入四氯合钯（II）酸和抗坏血酸，在Au NBPs尖端形成金属纳米颗粒Pd，得到具有各向异性的Pd
‑
Au异质结构纳米双锥PTA NBPs；（2）在电极上修饰具有各向异性的Pd
‑
Au异质结构纳米双锥PTA NBPs，形成PTA NBPs电极，取含核酸探针probe DNA的缓冲液滴到PTA NBPs电极上在室温下封闭，获得probe/PTA NBPs/电极，将probe/PTA NBPs/电极浸泡在含有双适配体dual
‑
aptamer的杂交缓冲液中，反应形成dual
‑
aptamer /probe/PTA NBPs/电极，即为对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器。
[0013]作为优选，将10 μL 0.5 μM probe DNA滴到PTA NBPs/GC电极上，并在4 ℃条件下组装13 h，以金
‑
硫键的方式连接到PTA NBPs/GC电极表面。
[0014]进一步地，电极在50 μL dual
‑
aptamer杂交缓冲液浸泡，然后和不同浓度的外泌体在37
ꢀ°
C孵育，每一步结束后，用PBS清洗修饰后的电极，洗脱非特异性吸附的物质。
[0015]本专利技术所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器在检测肿瘤细胞外泌体中的应用。
[0016]其中，所述应用过程为：将制备对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器浸泡在含肿瘤细胞外泌体悬液中进行孵育反应捕获外泌体，在近红外激光的照射下测试不同已知外泌体浓度的光电流信号。
[0017]其中，所述近红外激光的照射波长可根据纳米材料尺寸在500
‑
1064 nm进行调节，功率密度为100
‑
1500 mWcm
‑2。
[0018]优选的，近红外激光的照射所引起的LSPR效应可增强Pd
‑
Au异质结构纳米双锥电催化活性，所述近红外激光的照射波长为808 nm，功率密度为500 mWcm
‑2。
[0019]其中，所述外泌体浓度为1.6
×
103‑
3.0
×
10
6 particles μL
‑1，室温孵育反应时间为100
‑
120 min。
[0020]优选的，所述外泌体浓度为1.6
×
103，3.0
×...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器，其特征在于，所述电化学传感器包括电极、具有各向异性的Pd
‑
Au异质结构纳米双锥、双适配体和核酸探针，所述具有各向异性的Pd
‑
Au异质结构纳米双锥修饰在电极表面，所述双适配体通过核酸探针固定在修饰了具有各向异性的Pd
‑
Au异质结构纳米双锥的电极表面。2.根据权利要求1所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，其特征在于，所述双适配体为特异性识别CCRF
‑
CEM肿瘤细胞中过表达的膜蛋白PTK7的适配体。3.根据权利要求1所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，其特征在于，所述核酸探针为与双适配体杂交的且可固定在Pd
‑
Au异质结构纳米双锥上的DNA序列。4.根据权利要求1所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，其特征在于，所述具有各向异性的Pd
‑
Au异质结构纳米双锥为具有表面等离子共振效应的双金属异质结构纳米材料。5.根据权利要求1所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测的电化学传感器，其特征在于，所述电极为玻碳电极、金电极、铂电极、热解石墨电极或ITO电极中的任意一种。6.一种权利要求1所述基于等离子共振增强对肿瘤细胞外泌体检测电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备金种子将其加入到生长液中形成Au NBPs溶液，离心分散到CTAC溶液中，随后加入AgNO3和抗坏血酸混合均匀，将混合溶液油浴加热形成Au NBP@Ag纳米结构，再次离心后分散到CTAB溶液中，加入四氯合钯（II）...

【专利技术属性】
技术研发人员：张卉，姜文丽，孙蝶，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：