一种用于指导癫痫药物使用的多重HLA分型检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于指导癫痫药物使用的多重HLA分型检测方法，涉及基因工程技术领域，该多重HLA分型检测的具体步骤包括：步骤一、核酸提取；步骤二、HLA分型检测；步骤三、毛细管电泳测序；步骤四、检测结果分析；步骤五、检测结果判读。本发明专利技术为一种用于指导癫痫药物使用的多重HLA分型检测方法，其采用多重ARMS

【技术实现步骤摘要】
一种用于指导癫痫药物使用的多重HLA分型检测方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体为一种用于指导癫痫药物使用的多重HLA分型检测方法。

技术介绍

[0002]人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)是由HLA基因复合体所编码的产物，定位于第6染色体短臂上。HLA系人类组织相容性复合体(MHC)的表达产物，是构成移植排斥反应的重要抗原物质。HLA基因复合体不仅是多基因的而且是多等位基因的，HLA基因的多态性决定了在个体间可以产生高度多样化的HLA蛋白，也决定了不同个体处理和呈递同一种抗原的能力不同，从遗传水平上调控免疫应答功能，从而使不同个体对同一种抗原的免疫应答可表现出个体差异。这种个体差异或产生保护性免疫，或形成免疫耐受，或出现自身免疫倾向，或表现为HLA相关疾病，也会引起药物不良反应。HLA分型的方法有血清学分型、细胞学分型和DNA分型，其中DNA分型是目前使用最多也最广泛的。
[0003]目前基于DNA分型的HLA分型检测取得医疗器械证的不多，并且取证的试剂盒均只能检测一种分型，市面上的试剂盒有基于荧光定量PCR(qPCR)和测序法检测。
[0004]基于DNA分型的HLA检测方法，无论是基于测序还是qPCR方法，目前大部分仅对一种分型进行检测，很难做到多种HLA分型同时检测。而qPCR受限于其荧光通道和检测特异性限制，测序方法受限于操作繁琐，通量低等，均不可实现多重HLA分型检测。
[0005]经检索，一份申请日为2014.06.26，授权公告号为CN 104046696B的“快速检测HLA
‑
B*1502等位基因的引物、试剂及方法”的中国专利，该专利提供了一种快速检测HLA
‑
B*1502基因的引物，其包含SEQ ID NO.1
‑
4所示的检测引物EPF01、EPR01、EPF02和EPR02，所述四种引物分别组成引物组P1和P2，其中P1组为
[0006]EPF01
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EPR01
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EPF02
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EPR02，P2组为EPF01
‑
EPR02
‑
EPF02
‑
EPR01。该引物还进一步包含SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的内对照引物NCXF和NCXR。还提供了一种快速检测HLA
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B*1502基因的试剂盒，其包含PCR反应混合液和Taq酶，所述PCR反应混合液中分别包含如上所述的引物组P1和P2，所述Taq酶的浓度优选为5U/μL。
[0007]但是，该专利是基于PCR
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SSP技术开发的HLA
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B*1502基因筛查试剂盒，其只能检测一种分型，该测序方法还存在受限于操作繁琐，通量低等问题，而且很难做到多种HLA分型同时检测，从而无法实现多重HLA分型检测。

技术实现思路

[0008]专利技术的目的是为了解决上述
技术介绍
中存在的问题，而提出一种用于指导癫痫药物使用的多重HLA分型检测方法。
[0009]为实现上述目的，专利技术提供如下技术方案：
[0010]一种用于指导癫痫药物使用的多重HLA分型检测方法，该多重HLA分型检测的具体步骤包括：
[0011]步骤一、核酸提取；
[0012]根据DNA核酸提取试剂盒的操作说明书操作，从样本中提取DNA，并将核酸储存于
‑
20℃备用。
[0013]步骤二、HLA分型检测；
[0014]S1、准备试剂，确保引物Mix、SU7 PCR Mix(2X)在冰上化冻，短暂振荡混匀离心后置于冰上。
[0015]S2、根据PCR反应体系进行配制，并保持反应体系在冰上；其中，PCR反应体系如下：
[0016]组分体积(10uL体系)终浓度SU7 PCR Mix 2
×
5uL1x引物Mix(1uM)1uL0.1uM模板(DNA)1uL
‑
ddH2O3uL
‑
[0017]注意：模板浓度控制在5
‑
50ng/uL，浓度过高建议稀释后加样。
[0018]S3、将PCR管盖紧后做好标记后，短暂涡旋振荡离心，将反应体系放入PCR仪中，进行扩增反应；其中，扩增反应步骤如下：
[0019][0020]S4、反应结束后，将PCR产物直接在毛细管电泳仪上检测，或者将PCR产物短暂保存在4℃的冰箱内。
[0021]2.根据权利要求1所述的一种用于指导癫痫药物使用的多重HLA分型检测方法，其特征在于：若将PCR产物直接在毛细管电泳仪上检测，该多重HLA分型检测的具体步骤还包括：
[0022]步骤三、毛细管电泳测序；
[0023]注意：本方法采用溯远毛细管电泳仪Classic 116进行检测，测序反应也可以在ABI 3730xL，ABI 3500，ABI 3130xL进行。
[0024]S1、向毛细管电泳仪中更换电泳Buffer并添加分离胶。
[0025]注意：毛细管电泳反应干扰因素多，尽可能保证试剂材料干净不受污染，胶管路中存在气泡及时排出，否则影响电泳。
[0026]S2、将毛细管电泳仪开机，打开软件并建立连接。
[0027]S3、将反应管按顺序放入测序盒中，安装到位后关闭仪器门。
[0028]S4、通过软件新建检测表单。
[0029]S5、选择对应的检测方法。
[0030]S6、根据样品顺序，输入样品名称，选择对应参数。
[0031]S7、设置完成后进行检测。
[0032]步骤四、检测结果分析；
[0033]S1、打开分析软件；
[0034]S1、添加需要分析的样品数据结果；
[0035]S1、选择分析方法、Panel和内标等信息；
[0036]S1、运行分析；
[0037]步骤五、检测结果判读；
[0038]首先判断内参峰，若内参峰不存在，则本次检测无效；若内参峰存在，只有在检测结果同时出现Exon 2和Exon 3两个信号峰时，才能判定检测到此分型；
[0039]其中，只检测到任一信号峰，都不能判定存在此分型。
[0040]上述步骤中，所用的实验试剂、实验耗材以及实验仪器如下：
[0041][0042][0043][0044]进一步作为优选方案，所述核酸提取中的样本为口腔拭子、唾液或者全血。
[0045]进一步作为优选方案，该多重HLA检测的分型包括HLA
‑
B*15:02(卡马西平、苯妥英、奥卡西平、拉莫三嗪)、HLA
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B*15:11(卡马西平)、HLA
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A*31:01(卡马西平)、HLA
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B*51:01(苯巴比妥)、HLA
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B*38:01(拉莫三嗪)、HLA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于指导癫痫药物使用的多重HLA分型检测方法，其特征在于，该多重HLA分型检测的具体步骤包括：步骤一、核酸提取；根据DNA核酸提取试剂盒的操作说明书操作，从样本中提取DNA，并将核酸储存于
‑
20℃备用；步骤二、HLA分型检测；S1、准备试剂，确保引物Mix、SU7 PCR Mix(2X)在冰上化冻，短暂振荡混匀离心后置于冰上；S2、根据PCR反应体系进行配制，并保持反应体系在冰上；S3、将PCR管盖紧后做好标记后，短暂涡旋振荡离心，将反应体系放入PCR仪中，进行扩增反应；S4、反应结束后，将PCR产物直接在毛细管电泳仪上检测，或者将PCR产物短暂保存在4℃的冰箱内。2.根据权利要求1所述的一种用于指导癫痫药物使用的多重HLA分型检测方法，其特征在于：若将PCR产物直接在毛细管电泳仪上检测，该多重HLA分型检测的具体步骤还包括：步骤三、毛细管电泳测序；S1、向毛细管电泳仪中更换电泳Buffer并添加分离胶；S2、将毛细管电泳仪开机，打开软件并建立连接；S3、将反应管按顺序放入测序盒中，安装到位后关闭仪器门；S4、通过软件新建检测表单；S5、选择对应的检测方法；S6、根据样品顺序，输入样品名称，选择对应参数；S7、设置完成后进行检测；步骤四、检测结果分析；S1、打开分析软件；S1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵炳，何群燕，陈志君，
申请(专利权)人：杭州盾恩医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：