一种基于双发夹核酸探针组装的外泌体检测方法技术

本发明专利技术涉及基于双发夹核酸探针组装的外泌体检测方法，可有效解决现有技术特异性和灵敏度较低，且操作麻烦的问题，其解决的技术方案是，包括以下步骤：1）发夹状探针H1的制备；2）发夹状探针H2的制备；3）信号探针的制备；4）外泌体检测；本发明专利技术利用能识别外泌体的核酸适配体与外泌体结合后促发双发夹核酸探针组装从而启动酶切实现肿瘤外泌体的检测，方法操作简单，检测特异性好，能很大程度降低假阳性信号，且灵敏度较高，是外泌体的快速检测方法上的创新。新。新。

【技术实现步骤摘要】
一种基于双发夹核酸探针组装的外泌体检测方法
一、

[0001]本专利技术涉及外泌体检测
，特别是一种基于双发夹核酸探针组装的外泌体检测方法。
二、
技术介绍

[0002]外泌体是一种由细胞分泌的小囊泡，其大小通常在30
‑
150纳米之间。这些囊泡携带细胞内部的多种物质，如蛋白质、RNA和DNA等，并将其释放到细胞外部。研究表明，肿瘤细胞在肿瘤的发生、发展及转移过程中都会分泌大量外泌体。由于其纳米级尺寸和表面蛋白特性，肿瘤外泌体能长期稳定存在于大多数体液(如外周血、尿液、唾液等)中。尽管其功能还有待深入研究，然而已有的报道显示，肿瘤外泌体在促进肿瘤微环境形成、肿瘤细胞增殖、肿瘤组织血管生成、免疫逃逸、肿瘤转移和耐药等方面均具有重要的作用。鉴于外泌体与其母细胞的同源性及与肿瘤等疾病发生发展的密切相关性，通过检测体液中的特定外泌体有望成为疾病诊断、疗效评估和预后监测的新策略。
[0003]核酸适配体是利用体外筛选技术从核酸分子文库中得到的与特定目标物结合的寡核苷酸片段，核酸适配体能与多种目标物高特异性结合，拥有与抗原...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种基于双发夹核酸探针组装的外泌体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1）发夹状探针H1的制备将含有能识别结合目标外泌体的适配体序列和触发酶切过程的序列溶解于缓冲溶液中，混匀后置于水浴中，逐渐升高温度至90℃，缓慢冷却至室温，利用核酸的互补杂交反应得到含有适配体序列和触发酶切序列的核酸探针溶液，即为发夹状探针H1；所述的适配体序列为5
’‑
GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG GTT
ꢀ‑3’
，如SEQ ID NO:1所示；所述的触发酶切过程的序列为5
’‑
GAC CTC AGC TA
‑3’ꢀ
，如SEQ ID NO:2所示；所述的发夹状探针H1序列为：5
’‑
GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG GTT TTT TTG ACC TCA GCT ACC AGG GTA
‑3’
， 如SEQ ID NO:3所示；2）发夹状探针H2的制备将5
’
端和3
’
端分别修饰荧光基团和猝灭基团的序列H2，溶解于缓冲溶液中，混匀后置于水浴中，逐渐升高温度至90℃，缓慢冷却至室温，利用核酸的互补杂交反应形成发夹状探针H2；所述的发夹状探针H2序列为5
’‑
FAM
‑
CGG ACA AGG TACT AGC TGA GGT CC
‑
BHQ
‑3’
，如SEQ ID NO:4所示；3）信号探针的制备将步骤1）制备的发夹状探针H1和步骤2）制备的发夹状探针H2混合在一起，涡旋混合仪上混匀后，即得信号探针；4）外泌体检测通过离心收集细胞上清液来源的外泌体，加入步骤3）制备的信号探针，外泌体与H1颈部的适配体序列结合，打开发夹结构释放出环部的触发序列，释放出的环部触发序列与发夹探针H2的环部序列结合，形成H1
‑
H2杂交双链，Nicking酶剪切H2中的位点，产生荧光，H2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫，汤进录，罗艳超，倪珊珊，王玉西，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：