分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物技术

本发明专利技术提供了一种分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物，涉及基因检测领域。该用于分析MSI的标志物包括分别位于SULF2、SEC31A、TGFBR2、EIF4E3、ACVR2A、TAOK3、DIDO1和UBAC2基因的标志物。本发明专利技术提供的检测方法基于熔解曲线分析法，具有分析速度快、成本低和准确度高等优点。本低和准确度高等优点。本低和准确度高等优点。

【技术实现步骤摘要】
分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，尤其是涉及一种分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物。

技术介绍

[0002]微卫星（microsatellite，MS）是遍布于人类基因组中以少数几个核苷酸（多为1~6个）为单位串联重复的DNA序列，也被称为短串联重复序列（short tandem repeat，STR），有单核苷酸、双核苷酸或多核苷酸重复，重复次数为5~50次。与正常细胞相比，肿瘤细胞内的微卫星由于重复单位的插入或缺失而导致微卫星长度的改变，被称为微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）。研究表明，MSI是由错配修复（MMR）基因发生缺陷引起的现象，与肿瘤的发生密切相关。MMR蛋白功能缺陷同时也会导致基因组呈现高突变表型，进而导致肿瘤发生风险增加。目前，MSI检测被美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）结直肠癌临床实践指南及中国临床肿瘤学会（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）结直肠癌诊疗指南推荐用于所有结肠直肠癌（colorectal，CRC）患者。MSI检测对于包括CRC和子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）在内的多种实体瘤患者均具有重要临床意义。
[0003]MSI分为三类：
①
高频微卫星不稳定（High
‑
frequency microsatellite instability，MSI
‑
H）：2个或2个以上微卫星位点不稳定（或检测的大板标记中>30％的位点不稳定）。
②
低频微卫星不稳定（Low
‑
frequency microsatellite instability，MSI
‑
L）：只有1个微卫星位点不稳定（10％～30％标记位点不稳定）。
③
微卫星稳定（Microsatellite stability，MSS）：无不稳定微卫星位点（<10％标记点不稳定）。
[0004]目前，多重荧光PCR
‑
毛细管电泳法检测MSI状态是国际公认的金标准，NCCN、ASCO等国际知名机构联合推荐。同时提取同一患者的正常组织和肿瘤组织样本DNA，采用多重荧光PCR的方法对检测位点进行扩增，再通过毛细管电泳对扩增产物进行检测，并利用专业软件对两种组织来源检测结果进行对比分析，能准确的给患者MSI状态进行分型。但是多重荧光PCR毛细管电泳法，耗材成本高，检测时间长，操作比较复杂。
[0005]免疫组化（IHC）方法可以对MMR相关蛋白（MLH1，MSH2，MSH6，PMS2）进行检测，需要将对应的蛋白进行荧光标记，通过显微镜观察是否在细胞内正常表达，来判断MMR是否存在缺陷。需要注意的是，以MMR蛋白/MSI检测作为初筛手段，有可能漏诊部分林奇综合征患者。MMR蛋白表达及MSI（基于不同的微卫星位点选择的DNA检测）对林奇综合征的检测敏感度分别为83%和77%~89%，提示即使对所有CRC患者进行MMR或MSI普筛，也可能存在高达10%的漏诊率由于需要肉眼观察，对观测者要求比较高，同时方法本身灵敏度相对金标准稍微低一些，因此，临床一般采用金标准毛细管电泳法为主，免疫组化为辅助。
[0006]二代测序（NGS）方法可以作为MSI检测的一种手段，通过构建文库，利用二代测序仪对文库进行测序，再用生信算法对MSI位点进行分析，判断MSI长度是否发生变化，来推断MSI位点是否存在不稳定。但是二代测序的检测耗时比较长，成本高，随着测序技术不断的
革新，仍在不断的探索中。
[0007]上述的几种检测MSI的方法各有所长，也各有缺点，当下迫切需要一种可以博采众长，既省时省力又节约成本，高精度，操作简单，实现MSI状态的检测方法。
[0008]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一组准确度高的用于分析微卫星不稳定性的标志物，以及检测上述标志物的引物探针组合物和试剂盒，以及它们的应用；本专利技术的目的还在于提供一种基于荧光PCR熔解曲线分析微卫星不稳定性状态的方法，以缓解现有技术中存在的检测MSI的方法中的至少一个缺陷。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于分析微卫星不稳定性的标志物，包含如下MS1~MS8中的至少1、2、3、4、5、6、7或8个标志物：MS1：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人基因SULF2并起始于chr20：47657577；MS2：包含9个连续T的同聚物重复，其定位在人SEC31A基因并起始于chr4：82864412；MS3：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人TGFBR2基因并起始于chr3：30650380；MS4：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人EIF4E3基因并起始于chr3：71690181；MS5：包含8个连续A的同聚物重复，其定位在人ACVR2A基因并起始于chr2：147926117；MS6：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人TAOK3基因并起始于chr12：118238179；MS7：包含11个连续A的同聚物重复，其定位在人DIDO1基因并起始于chr20：62905340；MS8：包含12个连续T的同聚物重复，其定位在人UBAC2基因并起始于chr13：99238595。
[0011]根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种用于检测上述标志物的引物探针组合物，所述引物探针组合物基于荧光PCR熔解曲线分析检测所述标志物，包含分别用于扩增各标志物的引物对和用于提供荧光信号的探针，所述引物对扩增各标志物的同聚物重复或其突变形式的区域；所述探针为分子信标探针，所述探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。
[0012]根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种用于检测上述试剂盒，包括检测上述标志物的检测试剂。
[0013]根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种上述用于分析微卫星不稳定性的标志物，或上述引物探针组合物，或上述试剂盒的在以下任意一项中的应用：（
ⅰ
）分析微卫星不稳定性；（
ⅱ
）制备用于分析微卫星不稳定性状态的产品；（
ⅲ
）制备癌症检测产品。
[0014]根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种基于荧光PCR熔解曲线分析微卫星不稳定性状态的方法，包括PCR扩增后生成熔解曲线数据，标志物的Tm值范围内有熔解峰，判定为微卫星不稳定位点；标志物的Tm值范围内无熔解峰，判定为微卫星稳定位点；然后根据微卫星不稳定位点个数判断待测样本的微卫星不稳定性状态；扩增步骤使用上述引物探针组合物进行扩增。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的标志物同聚物重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组用于分析微卫星不稳定性的标志物，其特征在于，包含如下MS1~MS8中的至少1、2、3、4、5、6、7或8个标志物：MS1：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人基因SULF2并起始于chr20：47657577；MS2：包含9个连续T的同聚物重复，其定位在人SEC31A基因并起始于chr4：82864412；MS3：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人TGFBR2基因并起始于chr3：30650380；MS4：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人EIF4E3基因并起始于chr3：71690181；MS5：包含8个连续A的同聚物重复，其定位在人ACVR2A基因并起始于chr2：147926117；MS6：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人TAOK3基因并起始于chr12：118238179；MS7：包含11个连续A的同聚物重复，其定位在人DIDO1基因并起始于chr20：62905340；MS8：包含12个连续T的同聚物重复，其定位在人UBAC2基因并起始于chr13：99238595。2.用于检测权利要求1所述标志物的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物基于荧光PCR熔解曲线分析检测所述标志物，包含分别用于扩增各标志物的引物对和用于提供荧光信号的探针，所述引物对扩增各标志物的同聚物重复或其突变形式的区域；所述探针为分子信标探针，所述探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，各引物对中包括限制性引物和过量引物，过量引物的数量大于限制性引物的数量，所述限制性引物与所述探针具有相同的方向，过量引物产生的单链模板与所述分子信标探针进行互补配对。4.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其特征在于，限制性引物与过量引物的摩尔比例为1:5~15。5.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，探针的Tm值不低于扩增步骤中的退火温度。6. 根据权利要求2~5任一项所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1~16中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16条；和/或，探针的核苷酸序列选自SEQ ID NO.19~26中的至少1、2、3、4、5、6、7或8条。7. 根据权利要求6所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括用于检测内参基因的引物对和探针，所述引物探针组合物中引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1~18；探针的核苷酸序列选自SEQ ID NO.19~27。8.用于检测权利要求1所述标志物的试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1所述标志物的检测试剂。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，包括（B1）或（B2）：（B1）权利要求2~7中任一项所述的用于扩增各标志物的引物对中的至少一对；（B2）权利要求2~7任一项所述的引物探针组合物；和，（C1）~（C3）中的至少一种：（C1）荧光熔解曲线法所使用的试剂；（C2）PCR buffer、盐、酶、dATP、dCTP、d...

【专利技术属性】
技术研发人员：相学平，桑志高，
申请(专利权)人：杭州布平医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：