用于孔雀石绿检测的G4-ThT荧光探针及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于孔雀石绿检测的G4

【技术实现步骤摘要】
用于孔雀石绿检测的G4
‑
ThT荧光探针及其检测方法


[0001]本专利技术属于孔雀石绿的快速检测方法，具体涉及利用与孔雀石绿具有较强结合力的G4
‑
ThT荧光探针对孔雀石绿进行检测的物质和方法。

技术介绍

[0002]孔雀石绿(Malachite Green，MG)别名中国绿、苯胺绿，是三苯甲烷类工业染料，用作丝绸、皮革和纸张的染色剂。20世纪30年代，人们发现孔雀石绿可以用来杀死鱼体表面的细菌、真菌和寄生虫，尤其是对水霉病有特效，许多国家将孔雀石绿作为杀虫剂和杀菌剂广泛用于水产养殖业中，预防和治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病以及小瓜虫病等。自20世纪90年代起，国内外的研究者陆续发现，孔雀石绿进入水生动物体内后，会快速代谢成脂溶性的隐色孔雀石绿(leucomalachite green，LMG)，孔雀石绿和隐色孔雀石绿在水产品和环境中残留时间长，其化学官能团“三苯甲烷(triphenylmethane)”有致癌、致畸、致突变(三致)等毒副作用。此外，水产养殖用水中残留的MG也可能对水资源造成严重污染。然而，由于孔雀石绿对鱼病的防治效果好、价格低廉，且现在无效果好的替代品，一些生产、经营者受利益驱动在食用水产品的养殖、运输、暂养等环节向水中添加孔雀石绿的违法问题目前仍较突出。
[0003]因此，快速、灵敏检测水中孔雀石绿，是监控和保障生鲜水产品和食品质量安全的有效手段之一。随着纳米材料研究的深入，纳米组装体系、人工组装合成的纳米结构的材料体系越来越受到人们的关注，这意味着纳米材料的研究已可以按照人们的意愿设计、组装、创造新的体系，更有目的地使该体系具有人们所希望的特性，技术上的飞跃，为纳米材料的应用进一步打开市场的大门，在广泛的领域形成一大批高技术产品。例如，有研究设计了基于荧光共振能量转移的Eu(III)功能化纳米MOF探针，用于痕量孔雀石绿的可逆传感(Food Chemistry 2021，354:129584)；还有利用两种发光材料构建用于MG定量和视觉检测的双发射比率传感器，在溶液中加入一定量的MG可使该比例传感器的颜色由红变蓝，并可通过测定荧光强度变化(F460 nm/666nm)实现对孔雀石绿的定量分析(Food Chemistry 2022，390:133156)。基于双劈裂功能核酸变构的方法构建的检测孔雀石绿的适配体传感器具有良好的检测性能，灵敏度和特异性都很好(Journal of Hazardous Materials 2022,425:127976)。但这些方法由于检测步骤繁琐，稳定性较差，仍难以满足生产和监管中简便、快速、灵敏检测痕量孔雀石绿的需求。

技术实现思路

[0004]为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提供了一种利用G4
‑
ThT结合孔雀石绿并使ThT与孔雀石绿之间发生内滤效应实现孔雀石绿灵敏检测的新方法。
[0005]本专利技术获得一条富含G碱基的DNA链，其形成的G
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四链体(G4)结构与孔雀石绿具有良好的亲和力，将G4链与硫黄素T(ThT)混合后组装成荧光探针G4
‑
ThT，其荧光对孔雀石绿有明显的响应。
[0006]本专利技术方法不需要其他材料的辅助即可实现孔雀石绿的灵敏检测，相比于其他方法更加经济、简便和省时。
[0007]本专利技术的技术方案包括：
[0008]一、一种用于孔雀石绿检测的G4
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ThT荧光探针：
[0009]由G4链和硫黄素T(ThT)混合形成G4
‑
ThT结构。
[0010]所述的G4链序列为SEQ ID NO.1，即5
’‑
TGAGGGTGGGTAGGGTGGGTAA
‑3’
。
[0011]本专利技术得到的G4链与孔雀石绿具有较强的亲和力，且该荧光探针只需常温混合进行自组装，无需其他步骤和仪器。
[0012]在孔雀石绿检测中的应用。
[0013]二、利用所述G4
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ThT荧光探针检测孔雀石绿的方法：
[0014]所述的G4
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ThT荧光探针检测孔雀石绿的方法步骤如下：
[0015]取G4链、硫黄素T(ThT)和待测浓度孔雀石绿溶液共同加入于缓冲液中振荡混匀，常温避光反应，用酶标仪测量荧光光谱，根据荧光强度判断孔雀石绿的浓度。
[0016]本专利技术的G4链与孔雀石绿具有良好的亲和力，与ThT结合后使ThT发出强烈荧光，而孔雀石绿通过引起G4
‑
ThT荧光的淬灭进而可检测孔雀石绿。
[0017]所述孔雀石绿的检测依据是G4
‑
ThT的荧光强度受待测靶标亲和性影响的变化；无孔雀石绿时，ThT与G4链产生强荧光，加入孔雀石绿后，G4链的结构更稳定，促进了孔雀石绿与ThT之间的荧光内滤效应，ThT荧光下降。
[0018]本专利技术的孔雀石绿引起的荧光下降不是由破坏G4
‑
ThT的结构引起的，而是孔雀石绿与ThT之间的荧光内滤效应。由于孔雀石绿与G4链具有良好的亲和力，孔雀石绿被吸附到G4
‑
ThT上，这将更有利于孔雀石绿与ThT之间的内滤效应，从而使荧光下降更明显，G4链对孔雀石绿检测起到了促进放大作用。
[0019]所述G4链、硫黄素T的化学计量比为1:2(物质的量之比)。
[0020]所述的缓冲液为含有10mM K
+
的hepes缓冲液(25mM的hepes，0.5％v/v的TritonX
‑
100，pH5.2)。
[0021]本专利技术方法在常温避光反应15min，即加入孔雀石绿后的检测时间为15min。
[0022]所述反应直接在常温25℃下进行。本专利技术方法的检测方式为混合一步检测，G4链、ThT和孔雀石绿直接一起混合或者先后任意混合，加样顺序的变化对检测的结果几乎无影响。
[0023]用酶标仪测在425nm激发波长下、450～600nm之间的荧光光谱，根据荧光光谱中488nm处荧光值的下降程度判断待测孔雀石绿溶液中的孔雀石绿的存在和量。
[0024]根据荧光光谱采用以下公式计算获得488nm处的荧光淬灭率，孔雀石绿的浓度越大，该荧光淬灭率下降得越多，在一定范围内呈线性关系：
[0025](F0‑
F)/F0[0026]其中，F0为未加孔雀石绿时的荧光强度，F为加入孔雀石绿后的荧光强度；
[0027]根据488nm处的荧光淬灭率结合预先实验标定绘制的荧光淬灭率和孔雀石绿的浓度之间的关系确定待测孔雀石绿溶液中的孔雀石绿的浓度。
[0028]本专利技术发现了荧光淬灭率和孔雀石绿的浓度之间存在近似线性关系，且呈正相关，可通过预先实验标定绘制荧光淬灭率和孔雀石绿的浓度之间的线性回归曲线作为关
系。
[0029]所述的预先绘制的线性回归曲线通过下述方法获得：将荧光探针分别与多份不同浓度且浓度已知的孔本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于孔雀石绿检测的G4
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ThT荧光探针，其特征在于：由G4链和硫黄素T混合形成。2.根据权利要求1所述的一种用于孔雀石绿检测的G4
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ThT荧光探针，其特征在于：所述的G4链序列为SEQ ID NO.1。3.权利要求1所述G4
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ThT荧光探针的应用，其特征在于：在孔雀石绿检测中的应用。4.利用权利要求1或2所述G4
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ThT荧光探针检测孔雀石绿的方法，其特征在于：方法步骤如下：取G4链、硫黄素T和待测孔雀石绿溶液共同加入于缓冲液中振荡混匀，常温避光反应，测量荧光光谱，根据荧光强度判断孔雀石绿的浓度。5.利用权利要求4所述G4
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ThT荧光探针检测孔雀石绿的方法，其特征在于：所述G4链、硫黄素T的化学计量比为1:2。6.利用权利要求4所述G4
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ThT荧光探针检测孔雀石绿的方法，其特征在于：所述的缓冲液为含有10mM K
+
的...

【专利技术属性】
技术研发人员：何开雨，李梦荣，徐霞红，王柳，权浩然，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：