一种在里氏木霉中提高木聚糖酶产量的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种在里氏木霉中提高木聚糖酶产量的方法。本发明专利技术以里氏木霉内源蛋白Xyn2作为融合表达元件，将融合表达元件Xyn2和木聚糖酶Xyn10A的编码基因连接至一起，形成融合蛋白基因，然后异源表达该融合蛋白，合成木聚糖酶。所述融合表达元件Xyn2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术方法获得的木聚糖酶酶活明显高于直接表达木聚糖酶Xyn10A，提供的重组里氏木霉xyn2

【技术实现步骤摘要】
一种在里氏木霉中提高木聚糖酶产量的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种在里氏木霉中提高木聚糖酶产量的方法及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]木质纤维素物质是生物质资源的主要成分，其开发利用对我国经济发展、环境保护等社会核心问题具有重要的战略意义。工业丝状真菌里氏木霉能够生产多种纤维素酶和半纤维素酶，在降解木质纤维素类物质中发挥重要作用。木聚糖酶是半纤维素酶系的主要组分，不仅能够通过降解木聚糖生产木寡糖、木糖等产品，并且能够通过与纤维素酶协同作用促进木质纤维素的整体高效降解。相对于纤维素酶，里氏木霉中木聚糖酶的表达分泌水平和酶活水平较低，因此，向里氏木霉引入高效的异源木聚糖酶能够促进木聚糖酶活性的有效提升，进而能够提高其对木质纤维素的整体降解能力。
[0003]里氏木霉由于具有强大的蛋白合成分泌能力及高安全性、可利用廉价原材料等诸多优势，也被开发作为底盘细胞用于异源蛋白的表达分泌。蛋白质的分泌生产有利于目标蛋白的后续纯化及规模放大。目前，常以主要纤维素酶CBHI的信号肽(N端17个氨基酸)引导异源蛋白表达分泌，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在里氏木霉中提高木聚糖酶产量的方法，其特征在于，所述方法是采用内源蛋白Xyn2作为融合表达元件引导异源木聚糖酶的表达。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合表达元件Xyn2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异源木聚糖酶为木聚糖酶Xyn10A。4.一株重组里氏木霉，其特征在于，是将权利要求2所述的内源蛋白Xyn2基因与权利要求3所述的木聚糖酶Xyn10A基因分别连接到骨架质粒上，再将重组质粒转化里氏木霉，得到重组里氏木霉。5.权利要求4所述的重组里氏木霉的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，经PCR扩增得到融合表达元件Xyn2序列；(2)以质粒pPICZαA
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Xyn10A为模板，经PCR扩增得到木聚糖酶Xyn10A序列；(3)通过重叠延申PCR将融合表达元件Xyn2和木聚糖酶Xyn10A的编码基因连接至一起，再以该片段为模板，经PCR扩增得到融合片段xyn2
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xyn10A；(4)以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，PCR扩增得到pyr4基因的上下游同源臂序列，连接入含有潮霉素抗性基因hph表达盒的载体pUC19
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hph中，然后在上游同源臂和hph表达盒之间顺序引入启动子tcu1和终止子TrpC，得到重组表达载体pUC19
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Ptcu1
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pyr4site；(5)将融合片段xyn2
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xyn10A连接至重组表达载体pUC19
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Ptcu1
‑
pyr4site的启动子和终止子之间，得到重组表达载体Ptcu1
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xyn2
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xyn10A；(6)将重组表达载体Ptcu1
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xyn2
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xyn10A转入里氏木霉QM9414
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Δpyr4原生质体中，经再生、筛选及验证，得到重组里氏木霉xyn2
‑
xyn10A。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR扩增使用的引物序列如下：xyn2F:5
’‑
ACGACCTGGTTGATACGACAGGCGCGCCATGGTCTCCTTCACCTCCCTC
‑3’
；xyn2R:5
’‑
TCTGGTTCGTATCGACGTAGGTGTCAGAACCTCCAGAACCTCCGCTGACG GTGATGGAAGCA
‑3’
；步骤(2)中，所述PCR扩增使用的引物序列如下：xyn10F:5
’‑
TGCTTCCATCACCGTCAGCGGAGGTTCTGGAGGTTCTGACACCTACGTCG ATACGAACCAG
‑3’
；xyn10R1:5...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘巍峰，张伟欣，吕文昊，夏雨潇，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：