基于ARGETATRP和ROP双聚合级联放大的高灵敏cTnI检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了基于ARGET ATRP和ROP双聚合级联放大的高灵敏cTnI检测试剂盒、使用方法及其应用，该试剂盒包括：金电极、Apt1、Apt2、MCH、BIBB、ARGET ATRP反应溶液、NCA

【技术实现步骤摘要】
基于ARGET ATRP和ROP双聚合级联放大的高灵敏cTnI检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及基于ARGET ATRP和ROP双聚合级联放大的高灵敏cTnI检测试剂盒、使用方法及其应用，属于生物分析


技术介绍

[0002]心肌梗死已成为直接威胁生命的心血管疾病之一，其中超过一半的患者被诊断为急性心肌梗死(AMI)。一些AMI患者前期几乎没有明显症状，如胸部或背部疼痛、呼吸短促和烧心等，因此开发灵敏高效的AMI检测方法至关重要。AMI可通过多种心脏生物标志物进行诊断，包括心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T、肌酸激酶MB和肌红蛋白。这其中，cTnI已被公认为诊断AMI的首选生物标志物，cTnI的高灵敏和高选择性检测对AMI的早期诊断、疾病评估和预后分析具有重要意义。
[0003]目前，已有多种方法被报道用于检测cTnI，如酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法、化学发光免疫分析、荧光免疫分析、表面等离子体共振法、比色法和电化学生物传感器。电化学生物传感器是一种典型的多学科交叉和发展的产物，作为一种新兴的检测方法，由于其灵敏度高、操作简单、特异性强等优点受到了广泛关注。特别是基于适配体的电化学传感器，由于其对抗体具有特异性高、免疫原性低、体积小、化学稳定性好、电化学单元易于修饰等优点，越来越受到研究人员的青睐。
[0004]传统的电化学方法是将一个电活性标记物偶联到目标生物分子上，操作简单，价格低廉，但其灵敏度有限不能实现高灵敏检测。研究表明，与纳米技术放大信号相比，聚合反应通过控制聚合物链的动态生长实现信号放大，可有效提高检测灵敏度。而且其具有反应条件温和、操作简便的优势。其中，原子转移自由基聚合(ATRP)具有适用的单体种类较多，分子量分布较窄，可以用来制备接枝共聚物等优良特性。ARGET ATRP反应主要基于使用有机还原剂如抗坏血酸和葡萄糖来平衡CuI和CuII，以将Cu催化剂的浓度从10000ppm降低到10ppm，允许受控聚合更进一步，在工业和生物医学方面具有很大的应用前景。开环聚合(ROP)是一种高效的活性聚合反应，具有原子经济性和化学特异性的优点，所制备的聚合物具有良好的生物相容性和生物降解性，在农业、医学和制药等领域引起广泛关注。
[0005]综上，本专利技术目的是研发出以NCA
‑
Fc作为单体，生成的ATRP聚合物作为ROP反应的大分子引发剂，基于ARGET ATRP和ROP双聚合级联放大的电化学试剂盒，使其具有灵敏度高、选择性好等特点，可用于cTnI的高灵敏检测。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种基于ARGET ATRP和ROP双聚合级联放大的高灵敏cTnI检测试剂盒、使用方法及其应用，该试剂盒具有选择性好、灵敏度高等特点，在分析真实血清样品时也具有良好的准确性和适用性。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案之一是：
[0008]基于ARGET ATRP和ROP双聚合级联放大的高灵敏cTnI检测试剂盒，其特征在于，包括：金电极、Apt1、Apt2、MCH、BIBB、ARGET ATRP反应溶液、NCA
‑
Fc、LiClO4、DMSO、DMF、乙醇、PBS缓冲液。
[0009]进一步，Apt1和Apt2的序列分别为：
[0010]Apt1：5
’‑
SH
‑
(CH2)6‑
CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA
‑3’
[0011]Apt2：5
’‑
NH2‑
(CH2)6‑
CGCATGCCAAACGTTGCCTCATAGTTCCCTCCCCGTGTCC
‑3’
。
[0012]进一步，ARGET ATRP反应溶液的制备方法为：
[0013]①
将CuBr2和Me6TREN溶解在DMSO中，制备成CuBr2和Me6TREN浓度均为10mM的CuBr2/Me6TREN溶液；
[0014]②
将单体NAMA溶解在PBS缓冲液中，制备成浓度为40mM的单体NAMA溶液；
[0015]③
将AA溶解在PBS缓冲液中，制备成浓度为2mM的AA溶液；
[0016]④
将上述
①②③
中溶液分别量取0.4mL，再加入2.8mL PBS缓冲液混合均匀，得到ARGET ATRP反应溶液。
[0017]进一步，NCA
‑
Fc的合成方法为：
[0018](1)称取二茂铁甲酸溶于DCM中，滴加三乙胺，再依次加入HBTU和HOBT，反应后，旋转蒸干，得到产物Fc
‑
OBT；
[0019](2)将TFA滴入Boc
‑
L
‑
Lys NCA的DCM溶液中，反应后，移入室温搅拌过夜，得到NCA产物；
[0020](3)将三乙胺滴入所制备的Fc
‑
OBT中，然后加入所制备的NCA，室温反应，薄层色谱法监测反应过程，反应结束后进行后处理得到单体NCA
‑
Fc。
[0021]进一步，步骤(1)和(2)中二茂铁甲酸：三乙胺：HBTU：HOBT：Boc
‑
L
‑
Lys NCA的摩尔比为1：2：1：1：1；
[0022]步骤(2)中TFA：Boc
‑
L
‑
Lys NCA：DCM的比例关系为0.41mL：1mmol：3mL；
[0023]步骤(1)和(3)中三乙胺的用量相同；
[0024]步骤(1)
‑
(3)中滴加条件均为0℃；步骤(1)的反应时间为1h，步骤(2)的反应时间为1h；
[0025]步骤(3)中后处理为依次用饱和NaHCO3溶液、0.5M盐酸溶液、饱和NaHCO3溶液和超纯水洗涤，分离DCM有机相，用无水Na2SO4干燥、过滤，真空干燥。
[0026]本专利技术的技术方案之一是：一种所述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0027](1)金电极的修饰
[0028]①
将Apt1溶液滴加到金电极上，反应，洗涤，吹干；
[0029]②
将步骤
①
的电极浸泡在MCH溶液中，反应，洗涤，吹干；
[0030]③
将待检测样品滴加至步骤
②
的电极表面，孵育，洗涤，吹干；
[0031]④
将Apt2溶液滴加到步骤
③
的电极上，反应，洗涤，吹干；
[0032]⑤
将步骤
④
的电极浸泡在BIBB溶液中，反应，洗涤，吹干；
[0033]⑥
将步骤
⑤
的电极浸泡在ARGET ATRP反应溶液中，反应，洗涤，吹干；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于ARGET ATRP和ROP双聚合级联放大的高灵敏cTnI检测试剂盒，其特征在于，包括：金电极、Apt1、Apt2、MCH、BIBB、ARGET ATRP反应溶液、NCA
‑
Fc。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括LiClO4、DMSO、DMF、乙醇、PBS缓冲液。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，Apt1和Apt2的序列分别为：Apt1：5
’‑
SH
‑
(CH2)6‑
CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA
‑3’
Apt2：5
’‑
NH2‑
(CH2)6‑
CGCATGCCAAACGTTGCCTCATAGTTCCCTCCCCGTGTCC
‑3’
。4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，ARGET ATRP反应溶液的制备方法为：
①
将CuBr2和Me6TREN溶解在DMSO中，制备成CuBr2和Me6TREN浓度均为10mM的CuBr2/Me6TREN溶液；
②
将单体NAMA溶解在PBS缓冲液中，制备成浓度为40mM的单体NAMA溶液；
③
将AA溶解在PBS缓冲液中，制备成浓度为2mM的AA溶液；
④
将上述
①②③
中溶液分别量取0.4mL，再加入2.8mL PBS缓冲液混合均匀，得到ARGET ATRP反应溶液。5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，NCA
‑
Fc的合成方法为：(1)称取二茂铁甲酸溶于DCM中，滴加三乙胺，再依次加入HBTU和HOBT，反应后，旋转蒸干，得到产物Fc
‑
OBT；(2)将TFA滴入Boc
‑
L
‑
Lys NCA的DCM溶液中，反应后，移入室温搅拌过夜，得到NCA；(3)将三乙胺滴入所制备的Fc
‑
OBT中，然后加入所制备的NCA，室温反应，薄层色谱法监测反应过程，反应结束后进行后处理得到单体NCA
‑
Fc。6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，步骤(1)和(2)中二茂铁甲酸：三乙胺：HBTU：HOBT：Boc
‑
L
‑
Lys NCA的摩尔比为1：2：1：1：1；步骤(2)中TFA：Boc
‑
L
‑
Lys NCA：DCM的比例关系为0.41mL：1mmol：3mL；步骤(1)和(3)中三乙胺的用量相同；步骤(1)
‑
(3)中滴加条件均为0℃；步骤(1)的反应时间为1h，步骤(2)的反应时间为1h；步骤(3)中后处理为依次用饱和NaHCO3溶液、0.5M盐酸溶液、饱和NaHCO3溶液和超纯水洗涤，分离DCM有机相，用无水Na2SO4干燥、过滤，真空干燥。7.一种如权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：高天雨，杨怀霞，周振波，程迪，刘艳菊，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：