一种去除脑膜炎球菌多糖内毒素的工艺制造技术

一种去除脑膜炎球菌多糖内毒素的工艺，其制作工艺为固体培养基传代→液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→沉淀离心聚集多糖→氯化钙解离→酒精去核酸→沉淀多糖→酚提去蛋白→内毒素去除→酒精沉淀多糖→真空干燥→溶解除菌→原液检定保存→半成品配制→成品，其特征是：所述的发酵罐培养，在培养过程中取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌，以确保杀菌安全又不损伤多糖抗原为宜；所述的离心去菌体后进行纯化，去核酸，沉淀多糖，多糖纯化，采用超速离心进一步去除内毒素，沉淀精制多糖，纯化多糖原液除菌过滤后，原液检定，于－２０℃以下保存，半成品可各由单批或多批原液合并后，用无菌无热原乳糖和灭菌注射用水稀释制成。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种去除脑膜炎球菌多糖内毒素的工艺，属生物医药制造领域。
技术介绍
Amprosch于1984年研制成功ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗，目 前世界上只有法国巴斯德生产该疫苗，2000年以前使用量非常小，由于 当时主要流行的为A、 B、 C群流行性脊髓脑膜炎。近年来由于沙特等中 东国家、布基纳发索等非洲国家爆发流行W135群流行性脑脊髓膜炎以 及美国等流行Y群流行性脊髓脑膜炎，巴斯德生产的ACYW135群脑膜炎 球菌多糖疫苗呈供不应求的趋势。国外的ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫 苗售价也比较高，在非洲等贫穷国家每支售价至少5美元，在美国等发 达国家售价每支高达55美元。脑膜炎球菌多糖疫苗是具有免疫效果好、不良反应率低的预防用生 物制品。临床试验表明，该制品接种后15天左右可达到最佳免疫效果， 保护率以免后血清IgG抗体4倍增长计算，可达90 99%。不良反应以 轻中度反应为主，巴斯德公司己使用约2亿剂，均未出现严重不良反应 事件。国内原有6个生物制品研究所生产A群脑膜炎球菌多糠疫苗，最近 两年中国生物技术集团内部调整后，只有兰州生物制品研究所和上海生 物制品研究所生产A群脑膜炎球菌多糠疫苗、A群C群脑膜炎球菌多3糖疫苗。国内生产的A群脑膜炎球菌多糖疫苗，A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗，采用A群奈瑟氏脑膜炎球菌29201菌株、与C群奈瑟氏脑膜炎球 菌29205菌株，菌株分别经固体培养基传代、液体培养基发酵罐培养、 离心去菌体、十六烷基三甲基溴化铵沉淀复合多糖、氯化钙解离、25% 酒精去核酸、75-80%酒精沉淀多糖、酚提去蛋白、酒精沉淀多糖、冻干 等工艺制作而成。A群脑膜炎球菌多糖疫苗、A群C群群脑膜炎球菌多糖疫苗工艺流 程固体培养基传代一液体培养基发酵罐培养一离心去菌体一沉淀离心 聚集多糖一氯化钙解离一酒精去核酸—沉淀多糖—酚提去蛋白—酒精 沉淀多糖一真空干燥一溶解除菌一原液检定保存一半成品配制—成品。工艺阐述生产用菌种为A群脑膜炎奈瑟氏球菌CMCC 29201 (A4) 菌株、C群脑膜炎奈瑟氏球菌Cll 29205菌株。菌种接种在含10%羊血普通琼脂培养基上，染色进行形态及生化反 应检查，镜检应为革兰氏阴性双球菌、单球菌。生化反应检查为发酵葡 萄糖、麦芽糖，产酸不产气；不发酵乳糖、甘露醇、果糖及蔗糖。生产 时启开工作种子批菌种，经适当传代，经检定合格后，接种于改良半综 合培养基或其他适宜培养基，制备数量适宜的生产用种子。上述技术客观存在的是虽然，国内已有A群流脑多糖疫苗，A+C群 脑膜炎球菌多糖疫苗上市，但其生产过程中没有采用去内毒素工艺，制品中 的内毒素含量远大于经采用去内毒素工艺的制品。如果流脑多糖疫苗生产工 艺中不采用去除内毒素工艺，疫苗使用时就存在着不安全因素。如90年代末 北方某单位生产的流脑多糖疫苗在四川绵阳地区给学龄儿童接种，出现大面 积发热、皮疹等副反应。80年代末本人曾亲自参与过处理一例3岁儿童接种 流脑多糖疫苗后死亡的案例。这些可能都与流脑多糖疫苗中内毒素含量有关，不排除个别人体对流脑多糖疫苗中的内毒素非常敏感所致。特别是A+C群流脑多糖疫苗抗原含量由A群流脑多糖疫苗的30 u g/人份增加到了 A群50 u g及C群50 u g共100 u g /人份，ACYW135群流脑多糖疫苗为200 u g /人份，内毒素含量也大幅度相应增加，更增加了制品的不安全因素。目前国内市售的A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗接种后，部分被接种者出现头昏、嗜睡、恶心、低热等副反应，可能都有制品中的内毒素含量有关。
技术实现思路
设计目的避免
技术介绍
中的不足之处，设计一种质地优良、安全可靠的A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的一种去除脑膜炎球菌多糖内毒素的工艺。设计方案本申请是在国内生产脑膜炎球菌多糖疫苗工艺的基础上进行重大工艺改进，增加了去除内毒素工艺，其各项质量指标均达到《WHO规程》要求。尤其内毒素指标多糖原液中内毒素降10倍以上，与市售疫苗相比产品内毒素降低50倍以上，制品中的内毒素含量远低于同类制品中内毒素的含量，而其它指标无显著性差异，使制品更加安全可靠。脑膜炎球菌多糖疫苗工艺流程固体培养基传代一液体培养基发酵罐培养一离心去菌体一沉淀离心聚集多糖一氯化钙解离一酒精去核酸一沉淀多糖—酚提去蛋白一内毒素去除一酒精沉淀多糖一真空干燥一溶解除菌一原液检定保存一半成品配制一成品。关键技术有两点a、 发酵罐培养。减少培养时间，但不减少脑膜炎多糖的产量、同时又要多糖分子量合格。培养时间长，随着细菌的死亡，大量内毒素释放到收获液中，使的内毒素难于最终去除。b、 超速离心去除制品中的内毒素。脑膜炎球菌多糖疫苗中的内毒素是引起不良反应的重要物质，必须用超速离心的方法加以去除。技术方案 一种去除脑膜炎球菌多糖内毒素的工艺，其制作工艺为固体培养基传代一液体培养基发酵罐培养一离心去菌体一沉淀离心聚集多糖一氯化韩解离一酒精去核酸一沉淀多糖一酚提去蛋白一内毒素去除一酒精沉淀多糖一真空干燥一溶解除菌一原液检定保存一半成品配制一成品，所述的发酵罐培养，在培养过程中取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养，取样进行菌液浓度测定及纯菌检査，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌，以确保杀菌安全又不损伤多糖抗原为宜；所述的离心去菌体后进行纯化，去核酸，沉淀多糖，多糖纯化，采用超速离心进一步去除内毒素，沉淀精制多糖，纯化多糖原液除菌过滤后，原液检定，于-2(TC以下保存，半成品可各由单批或多批原液合并后，用无菌无热原乳糖和灭菌注射用水稀释制成。本专利技术与
技术介绍
相比，通过工艺摸索，确定了合理的工艺路线，稳定技术工艺流程，保证了规模化生产的可能，经过培养中减少内毒素的释放量，并经超速离心进一步去除内毒素，脑膜炎球菌多糖疫苗中的内毒素是引起不良反应的重要物质，保证产品的安全性。具体实施例方式实施例1: 一种去除脑膜炎球菌多糖内毒素的工艺，其制作工艺为固体培养基传代一液体培养基发酵罐培养一离心去菌体一沉淀离心聚集多糖一氯化钙解离一酒精去核酸一沉淀多糖一酚提去蛋白一内毒素去除一酒精沉淀多糖一真空干燥一溶解除菌一原液检定保存一半成品配制一成品，所述的发酵罐培养，在培养过程中取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养，取样进行菌液浓度测定及纯菌检査，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌，以确保杀菌安全又不损伤多糖抗原为宜；所述的离心去菌体后进行纯化，去核酸，沉淀多糖，多糖纯化，采用超速离心进一步去除内毒素，沉淀精制多6糖，纯化多糖原液除菌过滤后，原液检定，于-20C以下保存，半成品可各由单批或多批原液合并后，用无菌无热原乳糖和灭菌注射用水稀释制成。工艺阐述生产用菌种为A群脑膜炎奈瑟氏球菌CMCC 29201 (A4)菌株、C群脑膜炎奈瑟氏球菌Cl 1 29205菌株、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌CMCC 29028菌株及Wl35群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种CMCC 29037菌株。菌种接种在含10%羊血普通琼脂培养基上，35 — 37'C， C02孵箱培养16_18小时，同样条件转种第二代本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种去除脑膜炎球菌多糖内毒素的工艺，其制作工艺为固体培养基传代→液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→沉淀离心聚集多糖→氯化钙解离→酒精去核酸→沉淀多糖→酚提去蛋白→内毒素去除→酒精沉淀多糖→真空干燥→溶解除菌→原液检定保存→半成品配制→成品，其特征是：所述的发酵罐培养，在培养过程中取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌，以确保杀菌安全又不损伤多糖抗原为宜；所述的离心去菌体后进行纯化，去核酸，沉淀多糖，多糖纯化，采用超速离心进一步去除内毒素，沉淀精制多糖，纯化多糖原液除菌过滤后，原液检定，于－２０℃以下保存，半成品可各由单批或多批原液合并后，用无菌无热原乳糖和灭菌注射用水稀释制成。

【技术特征摘要】
1、一种去除脑膜炎球菌多糖内毒素的工艺，其制作工艺为固体培养基传代→液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→沉淀离心聚集多糖→氯化钙解离→酒精去核酸→沉淀多糖→酚提去蛋白→内毒素去除→酒精沉淀多糖→真空干燥→溶解除菌→原液检定保存→半成品配制→成品，其特征是所述的发酵罐培养，在培养过程中取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭志军，
申请(专利权)人：浙江天元生物药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：86