褪黑素在抑制产肠毒素大肠杆菌黏附中的应用制造技术

本发明专利技术公开了褪黑素在制备抑制产肠毒素大肠杆菌对猪小肠上皮细胞黏附的药物中的应用。本发明专利技术首次发现褪黑素可以在体外抑制ETEC对IPEC

【技术实现步骤摘要】
褪黑素在抑制产肠毒素大肠杆菌黏附中的应用


[0001]本专利技术属于药物
，具体涉及褪黑素在抑制产肠毒素大肠杆菌黏附中的应用，特别涉及褪黑素在抑制产肠毒素大肠杆菌对小肠上皮细胞黏附中的应用。

技术介绍

[0002]畜牧业在我国国民经济中占有重要地位，养猪业是我国畜牧业的支柱产业。然而在当前养猪生产中，面临着“仔猪死亡率高”的难题，原因是断奶仔猪免疫系统发育不成熟，易感染疾病致死亡。新生仔猪大肠杆菌性腹泻是发生在初生仔猪中的一种急性，致死性传染病，在我国乃至世界养猪生产中广泛流行。产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的致病过程包括菌毛黏附素的定植过程和肠毒素的致病过程。黏附素是直接介导ETEC对宿主细胞黏附的物质，K88(F4)菌毛黏附素是猪源ETEC的一种最主要的黏附素。其中，FaeG是K88黏附素的主要黏附蛋白，由faeG基因编码。据统计，仔猪感染ETEC后的死亡率高达70％，每年造成巨大的经济损失，严重制约了我国生猪养殖产业的高效健康发展。目前针对这一问题所使用的药物价格昂贵，同时，因为抗药菌株日趋增多，用药效果大幅降低，即使是治愈存活的仔猪，其生长发育和生产性能也会严重滞后。因此，预防或缓解仔猪ETEC感染对我国生猪产业长足发展至关重要。
[0003]褪黑素(N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺，melatonin)是由哺乳动物松果体产生的一种胺类激素。近年来被发现可以作用于哺乳动物全身的多个器官组织和细胞，具有延缓衰老、增强免疫力、改善睡眠、调控生殖活动、抗击肿瘤及清除体内自由基等多种生理和药理作用。由于其众多的用途及安全性高等优点，褪黑素被美国FDA(食品药品监督管理局)和中国卫生部批准允许作为膳食补充剂和保健品使用。但其在细菌性疾病治疗领域的潜在应用在国内外还未见相关报道。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：为了降低ETEC对猪肠道上皮细胞的黏附，本专利技术所要解决的技术问题是提供了100μM褪黑素预处理6h可以显著下调ETEC中FaeG蛋白的丰度，从而抑制ETEC对猪小肠上皮细胞的黏附。
[0005]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了褪黑素在制备抑制产肠毒素大肠杆菌对小肠上皮细胞黏附的药物中的应用。
[0006]其中，所述药物为单组分或复合制剂。
[0007]其中，所述褪黑素的浓度为10nM～1mM。
[0008]其中，所述猪小肠上皮细胞包括但不仅限于IPEC
‑
J2细胞。
[0009]其中，所述药物包括下调FaeG蛋白表达的药物。
[0010]其中，所述产肠毒素大肠杆菌包括标准菌株ETEC F4ac、ETEC W25K、F4acΔfaeG缺失株或F4acΔfaeG/pfaeG回补株中的一种或几种。
[0011]作为优选，所述褪黑素的浓度为100μM。
[0012]其中，所述产肠毒素大肠杆菌(ETEC)为从仔猪肠道中分离的菌株，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)埃希氏菌属(Escherichia)成员，是一种革兰氏阴性菌。
[0013]其中，所述猪小肠细胞为市面上普遍存在的分离自新生仔猪小肠回肠或空肠段的细胞系。
[0014]其中，所述产肠毒素大肠杆菌与猪小肠上皮细胞的感染复数为10(用10MOI表示)。
[0015]本专利技术还提供了褪黑素在体外抑制ETEC对猪小肠上皮细胞的应用。
[0016]有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点是：
[0017](1)本专利技术首次发现褪黑素可以在体外抑制ETEC对IPEC
‑
J2的黏附，属于褪黑素的新用途。
[0018](2)本专利技术具体阐明了100μM褪黑素预处理ETEC 6小时可以有效降低FaeG黏附蛋白的表达，从而削弱ETEC对IPEC
‑
J2的黏附，有助于开发出一类新型的ETEC感染治疗制剂。
附图说明
[0019]图1、感染时不同浓度的褪黑素对ETEC黏附作用的影响；不同浓度的褪黑素预处理IPEC
‑
J2细胞对感染时ETEC黏附作用的影响；
[0020]图2、不同浓度的褪黑素预处理ETEC 6小时对ETEC黏附作用的影响；
[0021]图3、100μM褪黑素预处理ETEC 6小时对感染时ETEC黏附作用的影响；100μM褪黑素预处理ETEC F4ac 6小时对感染时ETEC F4ac黏附作用的影响；
[0022]图4、差异分析火山图；
[0023]图5、差异基因聚类热图；
[0024]图6、KEGG富集分析；
[0025]图7、生物过程富集结果；细胞组成富集结果；分子功能富集结果；
[0026]图8、GO富集与KEGG富集筛选结果；
[0027]图9、褪黑素对差异表达基因mRNA表达量的影响；
[0028]图10、褪黑素对FaeG黏附蛋白丰度的影响；
[0029]图11、褪黑素预处理ETEC F4ac，F4acΔfaeG缺失株和F4acΔfaeG/pfaeG回补株6h对其黏附作用的影响。
具体实施方式
[0030]下面通过具体的实施例对本专利技术进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0031]LB肉汤培养基为含胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L和氯化钠10.0g/L的水溶液。
[0032]LB固体培养基为含胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L和琼脂15g/L的固体培养基。
[0033]褪黑素母液的配置方法：
[0034]褪黑素母液(100mM)：于无菌操作台内，取0.2323g褪黑素溶于4.646mL水乙醇中，
再加入5.354mL的双蒸水。母液配制好后，过0.22μM滤膜并分装于2mL离心管中(每管1mL)。所有母液冻存于
‑
20℃冰箱中，备用。
[0035]实施例1：ETEC菌株和IPEC
‑
J2的培养
[0036]ETEC菌株的培养：从
‑
80℃冰箱取出用甘油冻存的试验菌株ETEC W25K，该菌株为实验室前期分离(PMID：24970825)。自然解冻后，用移液枪取1 0μL菌液加入提前准备好的装有10mL的LB培养基的无菌试管中，轻摇混匀后，置于参数为37℃、180rpm的摇床进行细菌活化，12h后在无菌操作台内将活化的菌液用一次性接菌环接种于提前准备的LB固体培养基，在37℃培养箱孵育12h，用接种环取单菌落接种于10mL LB液体培养基，再将其置于37℃、180rpm的摇床培养12h，取培养后的菌液100μμL于10mL LB液体培养基中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.褪黑素在制备抑制产肠毒素大肠杆菌对猪小肠上皮细胞黏附的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为单组分或复合制剂。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述褪黑素的浓度为10nM~1mM。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产肠毒素大肠杆菌包括菌株ETEC F4ac、ETEC W25K、F4acΔfaeG缺失株或F4acΔfaeG/pfaeG回补株中的一种或几种。5.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：任文凯，张青卓，范丽娟，洪翊棻，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：