一种评估活体内唾液酸化水平的高分子探针及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种评估活体内唾液酸化水平的高分子探针。它以支链末端为炔基的树枝状高分子为载体，表面同时修饰有半乳糖、花氰5荧光染料以及叶酸。检测方案通过将制得的高分子探针皮下注射到荷瘤小鼠的肿瘤区域。利用叶酸介导的靶向内吞使高分子探针进入肿瘤细胞内部。活体内的唾液酸转移酶会在高分子探针末端的半乳糖上连接唾液酸。用高碘酸钠将小鼠肿瘤组织切片中的唾液酸末端氧化出醛基基团，并进一步偶联上酰肼荧光素分子。通过荧光显微镜成像同时收集花氰5和荧光素的荧光信号，并利用软件获取二种荧光叠加区域的荧光素荧光强度，即可用于评估该肿瘤组织的唾液酸化水平。可用于评估该肿瘤组织的唾液酸化水平。可用于评估该肿瘤组织的唾液酸化水平。

【技术实现步骤摘要】
一种评估活体内唾液酸化水平的高分子探针及其制备方法
一、

[0001]本专利技术属于生物检测
，涉及一种评估活体内唾液酸化水平的高分子探针及其制备方法。
二、
技术介绍

[0002]唾液酸化是一种重要的糖基化过程，它可以将唾液酸修饰到蛋白质、脂质或核酸上的糖链的最外端。唾液酸作为聚糖的末端基团，是聚糖功能的主要执行体，介导了各种生理病理过程，特别是肿瘤细胞的迁移、免疫逃逸等。因此，评估活体内唾液化水平可以更精确地揭示唾液酸相关的生物过程，并为肿瘤的临床诊断和治疗提供新的理论指导和技术支持。虽然许多方法已经实现了直接检测细胞内唾液酸，但在活体水平对唾液酸化进行原位评估的方法仍然很少。
[0003]为了实现活体原位评估唾液酸化水平，该专利制备了一种高分子探针，建立了对活体原位唾液酸化水平进行评估的分析方法。
三、
技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是：以支链末端为炔基的树枝状高分子为载体，利用炔基和叠氮的点击化学反应连接一端为叠氮基团，另一端分别为半乳糖、氨基以及叶酸的聚乙二醇分子，再利用氨基和N
‑
羟基琥珀酰亚胺的偶联反应连接含有N
‑
羟基琥珀酰亚胺的花氰5荧光染料，制得高分子探针(图1)。检测方案通过将制得的高分子探针皮下注射到荷瘤小鼠的肿瘤区域(图2)。在叶酸介导的靶向内吞作用下，高分子探针可以快速进入肿瘤细胞内部。在活体内唾液酸转移酶的作用下，高分子探针末端的半乳糖会连接上唾液酸。一段时间后收集小鼠的肿瘤组织制备成切片，用高碘酸钠溶液进行孵育，特异性地将唾液酸末端氧化出醛基基团。随后加入酰肼荧光素分子，利用酰肼和醛基的偶联反应将唾液酸分子标记上荧光素。然后对处理好的切片进行荧光显微镜成像，同时收集花氰5和荧光素的荧光信号。通过图像处理软件获取与花氰5荧光区域有叠加的荧光素荧光区域，该双色荧光叠加区域的荧光素荧光强度即可用于评估肿瘤组织的唾液酸化水平。
[0005]本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0006]将支链末端为炔基的树枝状高分子与叠氮聚乙二醇半乳糖、叠氮聚乙二醇氨基、叠氮聚乙二醇叶酸、硫酸铜溶液、2
‑
(4
‑
((双((1
‑
叔丁基
‑
1H
‑
1，2，3
‑
三唑
‑4‑
基)甲基)氨基)甲基)
‑
1H
‑
1，2，3
‑
三唑
‑1‑
基)乙酸以及抗坏血酸钠在室温下搅拌过夜。反应结束后通过超滤提纯树枝状高分子，然后再加入N
‑
羟基琥珀酰亚胺花氰5在室温下过夜反应。反应结束后再次通过超滤提纯获得高分子探针(图1)。
[0007]本专利技术的工作原理：
[0008]本专利技术提出的评估活体内唾液酸化水平的高分子探针的制备流程如图1所示。以支链末端为炔基的树枝状高分子为载体，利用炔基和叠氮的点击化学反应同时共价修饰三种不同的功能聚乙二醇分子，其一端均为叠氮基团，另一端分别为半乳糖、氨基以及叶酸的
聚乙二醇基团；然后再利用氨基和N
‑
羟基琥珀酰亚胺的偶联反应连接含有N
‑
羟基琥珀酰亚胺的花氰5荧光染料，即可得到高分子探针。
[0009]本专利技术的工作原理如图2所示。将制得的高分子探针皮下注射到荷瘤小鼠的肿瘤区域。利用叶酸介导的靶向内吞使高分子探针进入肿瘤细胞内部。活体内的唾液酸转移酶会在高分子探针末端的半乳糖上连接唾液酸。将小鼠肿瘤组织切片用高碘酸钠溶液孵育，将唾液酸末端氧化出醛基基团。利用醛基和酰肼的偶联反应将唾液酸分子连接上酰肼荧光素分子。通过荧光显微镜成像同时收集花氰5和荧光素的荧光信号。利用图像处理软件获取花氰5荧光与荧光素荧光的叠加区域，该区域的荧光素荧光强度即可用于评估肿瘤组织的唾液酸化水平。
[0010]与现有技术相比，本专利技术具有以下特点：
[0011]本专利技术所制备的树枝状高分子探针具有较好的生物兼容性，可以实现活体内唾液酸化的原位可视化评估。
[0012]与已有的唾液酸化评估方法相比，本专利技术具有以下优点：
[0013]1.本专利技术所述的高分子探针制备方法简单，具有较小的空间尺寸，可以实现较高的荧光信号的空间特异性区分。
[0014]2.本专利技术所涉及的活体唾液酸化评估可以给出唾液酸化水平的可视化空间分布情况。
四、附图说明
[0015]图1.高分子探针的制备示意图
[0016]图2.利用高分子探针评估活体内唾液酸化水平的过程
五、具体实施方式
[0017]实施例1：结合图1，制备用于评估活体内唾液酸化水平的高分子探针。
[0018]将支链末端为炔基的第五代双三羟甲基丙烷芯树枝状高分子(溶解于1微升，5毫摩尔每升的DMSO溶液)，叠氮聚乙二醇半乳糖(30微升，10毫摩尔每升)，叠氮聚乙二醇叶酸(10微升，10毫摩尔每升)，叠氮聚乙二醇氨基(10微升，10毫摩尔每升)，硫酸铜溶液(10微升，500毫摩尔每升)，2
‑
(4
‑
((双((1
‑
叔丁基
‑
1氢
‑
1，2，3
‑
三唑
‑4‑
基)甲基)氨基)甲基)
‑
1氢
‑
1，2，3
‑
三唑
‑1‑
基)乙酸(50微升，200毫摩尔每升)以及抗坏血酸钠(100微升，1摩尔每升)混合，在室温下震荡过夜。混合液在10000转每分钟转速条件下超滤洗涤3次，每次10分钟，得到淡黄色溶液。再用磷酸盐缓冲液将上述淡黄色溶液定容至250微升，之后加入N
‑
羟基琥珀酰亚胺花氰5(10微升，10毫摩尔每升)在室温下反应过夜。将反应溶液同样在10000转每分钟转速条件下超滤洗涤3次，每次10分钟，即得到高分子探针。
[0019]实施例2：结合图2，利用高分子探针评估活体内唾液酸化水平。
[0020]将小鼠乳腺癌4T1细胞(1
×
106个/只)接种于裸鼠(雌性，6
‑
8周)后腿，构建小鼠4T1皮下肿瘤异种移植模型。待肿瘤体积增大至1cm3后，在小鼠肿瘤周围皮下注射100微升高分子探针。注射1小时后安乐死，收集小鼠肿瘤组织用4％多聚甲醛进行固定，随后将组织样本冷冻并切成薄片。在室温下，将高碘酸钠溶液(5毫摩尔每升)添加到肿瘤组织切片上表面并孵育30分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤3次后，在肿瘤组织切片上表面滴加含苯胺溶液(10
毫摩尔每升)和荧光素酰肼溶液(100微摩尔每升)，孵育反应1小时。再次用磷酸盐缓冲液洗涤3次后，用盖片密封，利用荧光显微镜进行荧光成像。将得到的双色荧光图片用MATLAB软件获取花氰5荧光与荧光素荧光的叠加区域，该区域的荧光素荧光强度即可用于评估肿瘤组织的唾液酸化水平。
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种评估活体内唾液酸化水平的高分子探针，其特征在于，所述的高分子探针以支链末端为炔基的树枝状高分子为载体，在其表面修饰三种不同的功能聚乙二醇分子和花氰5荧光染料制得。2.根据权利要求1所述的一种评估活体内唾液酸化水平的高分子探针，其特征在于，所述的三种不同的功能聚乙二醇分子一端均为叠氮基团，另一端分别是半乳糖基团，氨基基团和叶酸基团。3.根据权利要求1所述的一种评估活体内唾液酸化水平的高分子探针，其特征在于，所述的花氰5荧光染料是通过N
‑
羟基琥...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈云龙，鞠熀先，赵诗雅，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：