一种血管化胰岛类器官及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种血管化胰岛类器官及制备方法和应用。所述方法操作如下：步骤(1)细胞混合：将胰岛类器官/胰岛细胞团、人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞按比例混合，混合细胞于低吸附板中聚集成细胞球；步骤(2)细胞球重悬于Col

【技术实现步骤摘要】
一种血管化胰岛类器官及制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种血管化胰岛类器官及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]目前没有方法可以根治糖尿病，患者只能采用辅助手段来控制自身的血糖水平，胰腺(岛)移植是一个有效的替代疗法，其可以部分或完全恢复生理性胰岛素分泌。世界范围内利用埃德蒙顿方案移植胰岛取得良好效果。然而，移植胰岛分泌的胰岛素的功能并不是持久的；90％的患者5年后需要再次注射胰岛素来控制他们的血糖水平，据估计即使移植了多个供体的胰岛，移植后的胰岛素产量也只有健康人的20
‑
40％。利用干细胞构建血管化胰岛类器官可解决这一问题。
[0003]使用生物材料包裹胰岛可以保护它们免受免疫系统的侵害，减少免疫抑制剂的使用，免疫保护包埋细胞仍然是目前包埋材料研究中的一个重要方向。同时材料本身的生物相容性对于防止非特异性异物反应是必要的，在这种反应中，蛋白质吸附在胶囊周围，可以观察到胶原纤维沿着胶囊过度生长，形成纤维囊，导致内部胰岛坏死。细胞封装可分为大封装和微封装。大封装可将大量细胞封装在装置内，其便于移植。大封装装置可分为两大类:血管内和血管外。血管内装置使得移植物非常接近血流，方便胰岛对血糖水平的变化迅速做出反应。但如果所选择的生物材料生物相容性较低，则有可能出现血栓形成甚至设备堵塞的情况，这对患者来说是一个严重的风险。血管大封装装置主要由含有大量胰岛的封装室组成，内部由大量水凝胶包裹胰岛。这类装置可以很容易地移植到高度血管化的移植部位，但容易出现胰岛素延迟释放的可能。与大封装的胰岛相比，微封装可以提供较大的表面积/体积比，从而导致更好的扩散特性。
[0004]胰岛发育和内分泌功能的发挥也离不开血管网络。体外诱导构建的胰岛类器官与体内环境自然分化胰岛的主要区别之一就是它们的血管网络，其在天然胰岛和移植的胰岛中特别丰富，但在体外诱导产生类器官中很少。因此要发挥类器官的最大作用，还需在类器官成功构建的基础上实现其血管网络化。一方面可以提高其保真度，另一方面又可增加其生存能力和分泌功能，发挥更为长久有效的作用。
[0005]现有的生物材料并不能完全解决胰岛类器官的血管化及移植后的血管化问题，比如缺乏促进血管生成的功能，最终导致胰岛移植的效果欠佳。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种血管化胰岛类器官及制备方法和应用。本专利技术的目的是运用Col
‑
Gelma作为平台，通过提供环境促进胰岛类器官的血管化。将该血管化胰岛类器官移植给糖尿病受体，能解决宿主的免疫排斥反应和血管化生成的问题，延长移植物的存活时间，改善移植后血糖控制效果。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面，提供一种血管化胰岛类器官的制备方法，所述方法操作如下：
[0008]步骤(1)细胞混合：将胰岛类器官/胰岛细胞团、人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞按比例混合，混合细胞于低吸附板中聚集成细胞球；
[0009]步骤(2)细胞球重悬于Col
‑
Gelma水凝胶溶液中，在固化光源下固化；
[0010]步骤(3)固化结束后采用PBS清洗固化材料，清洗后加入血管化类器官培养基培养，培养时间为1天
‑
10天；
[0011]所述Col
‑
Gelma水凝胶溶液的制备过程如下：2
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5mg/mLⅠ型胶原蛋白溶液中加入光交联剂LAP，溶解完全后加入称量好的Gelma，35
‑
38℃水浴锅中溶解完全，过滤器过滤即得；所述Col
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Gelma水凝胶的使用量为80
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120万细胞/mL水凝胶。本申请提供的Col
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Gelma水凝胶溶液通过提供环境促进胰岛类器官的血管化，而且不需像现有技术中低温配制，再恢复至37℃左右进行固化，缩短实验周期，而且本专利技术采用的水凝胶具有类细胞外基质特性，适于细胞生长和分化的三维结构，良好的温敏凝胶特性和可降解性以及血管化的优势。
[0012]进一步地，步骤(1)细胞混合的具体操作如下：
[0013]S1将胰岛类器官/胰岛细胞团悬于血管化类器官培养基后移入低吸附板，每孔接种3
‑
5个细胞团；此时低吸附板中含有微量的培养基。
[0014]S2将人脐静脉内皮细胞和和间充质干细胞悬于血管化类器官培养基中，充分混合后离心去除上清，用血管化类器官培养基重悬细胞，将细胞悬液(每孔加入40
‑
60uL)移入低吸附板，每1
‑
2天换一次培养基；培养4
‑
6天，细胞聚集成较为紧实的细胞球。
[0015]作为优选，所述胰岛类器官/胰岛细胞团、人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的细胞数量比为40
‑
60：30
‑
40：5
‑
7。
[0016]作为优选，所述血管化类器官培养基为：胰岛类器官/胰岛细胞团培养基、Huvec培养基和MSC培养基按2
‑
3：5
‑
6：1
‑
2的质量比进行配制；
[0017]胰岛类器官/胰岛细胞团培养基：DMEM/F12培养基+BSA 2％
‑
3％+ITS
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X1.0％
‑
1.5％+NEAA 0.2％
‑
0.3％+牛磺酸1/55
‑
1/60+烟酰胺1/400
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1/350+GLP
‑
11/3900
‑
1/3800。混合细胞前胰岛类器官/胰岛细胞团采用该培养基进行培养；
[0018]Huvec培养基为商业化ECM
‑
2培养基；
[0019]MSC培养基成分为：DMEM/F12培养基+10
‑
14％胎牛血清(FBS)+0.8
‑
1.5％青霉素/链霉素双抗(P/S)。
[0020]作为优选，所述Gelma的浓度为10％
‑
15％，所述光交联剂LAP的加入量为0.2
‑
0.5％；
[0021]作为优选，培养皿中铺多个15
‑
30μL的材料细胞球，使用蓝光交联15
‑
30s使其固化，所述固化光源为EFL
‑
LS
‑
1601；波长为400
‑
410nm。
[0022]按每毫升计算，Ⅰ型胶原蛋白溶液的配置如下：540
‑
560μL溶有0.05
‑
0.2％冰醋酸的7
‑
8mg/mL的Ⅰ型胶原蛋白溶液+1
‑
2.5μL 5N(mol/L)NaOH溶液+400
‑
450μL的ECM内皮细胞培养基。
[0023]作为优选，所述胰岛类本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血管化胰岛类器官的制备方法，其特征在于，所述方法操作如下：步骤(1)细胞混合：将胰岛类器官/胰岛细胞团、人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞按比例混合，混合细胞于低吸附板中聚集成细胞球；步骤(2)细胞球重悬于Col
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Gelma水凝胶溶液中，在固化光源下固化；步骤(3)固化结束后采用PBS清洗固化材料，清洗后加入血管化类器官培养基培养，培养时间为1天
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10天；所述Col
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Gelma水凝胶溶液的制备过程如下：2
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5mg/mLⅠ型胶原蛋白溶液中加入光交联剂LAP，溶解完全后加入称量好的Gelma，35
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38℃水浴锅中溶解完全，过滤器过滤即得。2.根据权利要求1所述的血管化胰岛类器官的制备方法，其特征在于，步骤(1)细胞混合的具体操作如下：S1将胰岛类器官/胰岛细胞团悬于血管化类器官培养基后移入低吸附板，每孔接种3
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5个细胞团；S2将人脐静脉内皮细胞和和间充质干细胞悬于血管化类器官培养基中，充分混合后离心去除上清，用血管化类器官培养基重悬细胞，将细胞悬液移入低吸附板，每1
‑
2天换一次培养基；培养4
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6天，细胞聚集成较为紧实的细胞球。3.根据权利要求2所述的血管化胰岛类器官的制备方法，其特征在于，所述胰岛类器官/胰岛细胞团、人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的细胞数量比为40
‑
60：30
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40：5
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7。4.根据权利要求2所述的血管化胰岛类器官的制备方法，其特征在于，所述血管化类器官培养基为：胰岛类器官/胰岛细胞团培养基、Huvec培养基和MSC培养基按2
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3：5
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6：1
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2的质量比进行配制；胰岛类器官/胰岛细胞团培养基：DMEM/F12培养基+BSA2％
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3％+ITS
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【专利技术属性】
技术研发人员：司维，马祥，李汶联，董为鑫，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：