一种CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法及使用该方法的试剂盒技术

本公开提供了一种CRISPR/Cas12a酶驱动的OTA检测方法及使用该方法的试剂盒。利用了OTA与crRNA竞争性结合OTA核酸适配体的原理。待测样品中没有OTA时，crRNA与OTA核酸适配体通过互补序列结合，激活Cas12a酶的切割能力，对修饰了荧光信号分子的ssDNA(ssDNA

【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR/Cas12a
‑
crRNA驱动的OTA检测方法及使用该方法的试剂盒


[0001]本公开涉及生物检测
，尤其涉及一种CRISPR/Cas12a
‑
crRNA驱动的OTA检测方法及使用该方法的试剂盒。

技术介绍

[0002]赭曲霉毒素A(OchratoxinA,OTA)是一种2B类致癌物。作为一种剧毒物质，具有很强的肾毒性、肝毒性、免疫毒性和致癌性等，严重威胁着人类和动物的健康。OTA在生长、收获、储存和运输等过程中容易污染许多农产品，包括玉米、小麦、咖啡、大麦、大米、蔬菜、水果、肉类和葡萄酒等。虽然在食物中的存在微量，但由于其具有热稳定性，并且在人体内容易被吸收但难以排泄，会使它在靶器官中蓄积，最终导致毒性作用。因此，迫切需要开发高灵敏度的食品中OTA检测方法，以减少OTA的摄入，保护人畜健康。
[0003]传统的OTA检测方法包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等，均符合一般检测要求，但需要昂贵的设备、熟练的操作人员和复杂的前处理过程，极大地阻碍了其在真实样品中的实际应用。酶联免疫吸附测定(Enzyme
‑
linkedimmunosorbentassay,ELISA)法因具有灵敏度高、选择性强、无需样品预处理纯化(或单纯纯化)、样品处理能力大等优点，是目前OTA快速批量检测的主要方法。但其所依赖的抗体识别元件存在制备困难、试剂寿命短、价格昂贵、检测时间长、可重复性差、灵敏度较差等缺陷这些都限制了其在样品检测中的应用。

技术实现思路

[0004]本公开提供了一种CRISPR/Cas12a
‑
crRNA驱动的OTA检测方法及使用该方法的试剂盒，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。
[0005]本申请提供了一种由CRISPR/Cas12a
‑
crRNA驱动的OTA检测方法，所述方法包括：
[0006]向孔板的孔中加入链霉亲和素溶液，在3
‑
5℃下孵育15
‑
17h，洗板，得到链霉亲和素修饰的微孔板；
[0007]向链霉亲和素修饰的微孔板的板孔中加入90
‑
110μL浓度为9
‑
11mg/mL的牛血清蛋白溶液封闭板孔，洗板，得到牛血清蛋白溶液封闭的微孔板；
[0008]向牛血清蛋白溶液封闭的微孔板的板孔中加入生物素修饰的OTA核酸适配体，在20
‑
26℃下摇匀，洗板，得到OTA核酸适配体包被的孔板；
[0009]在缓冲液中，将Cas12a和等量的crRNA在20
‑
27℃条件下孵育9
‑
11min，加入ssDNA
‑
FQ报告基因，混匀，得到Cas12a
‑
crRNA
‑
ssDNA
‑
FQ混合液；
[0010]将待测原料粉碎后溶解、离心，收集上清液作为样品原液，过滤，稀释8
‑
11倍后获得样品待测液，向OTA核酸适配体包被的孔板的孔中分别加入90
‑
110μL样品待测液以及OTA浓度为0pg/ml的对照品，孵育0.9
‑
1.5h,洗板,得到孵育了样品待测液、OTA标准品和对照品的孔板；
[0011]向孵育了样品待测液、OTA标准品和对照品的孔板的孔中加入90
‑
110μLCas12a
‑
crRNA
‑
ssDNA
‑
FQ混合物，反应至90
‑
110min后，得到目标检测物；
[0012]在λex＝590nm,λem＝620nm条件下，对目标检测物进行荧光检测，得到荧光信号；
[0013]通过对比样品待测液的荧光信号值与对照品的荧光信号值判断样品待测液内是否存在OTA。
[0014]在一可实施方式中，将所述样品待测液的荧光信号与对照品的荧光信号值进行比较，确定所述样品待测原料是否含有OTA，包括：
[0015]若所述荧光信号低于对照品的荧光信号值，确定所述待测原料中含有OTA；
[0016]若所述荧光信号不低于对照品的荧光信号值，确定所述待测原料中不含有OTA。
[0017]在一可实施方式中，所述检测方法还包括：OTA核酸适配体包被的孔板的孔中分别加入90
‑
110μL样品待测液、多组浓度为0.2
‑
1200pg/ml的OTA标准品、OTA浓度为0pg/ml的对照品，多组所述OTA标准品的浓度不同，用对照组的荧光信号值减去各OTA标准组的荧光信号值，得到各浓度标准组的荧光信号差值ΔI，绘制ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线；用对照组的荧光信号值减去样品待测液的荧光信号值，得到ΔI
样品
，将ΔI
样品
代入ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线，计算出样品待测液浓度的对数，求其反对数，再乘以8
‑
11倍得到待测样品中的OTA浓度。
[0018]在一可实施方式中，所述链霉亲和素溶液的添加量为90
‑
110μL，所述链霉亲和素溶液的浓度为1
‑
20μg/mL；所述链霉亲和素溶液的溶剂为碳酸钾溶液，所述碳酸钾溶液的浓度为0.05
‑
0.15mol/L，PH为9.5
‑
9.7。
[0019]在一可实施方式中，所述洗板操作为：采用190
‑
210μLPBS溶液进行洗板，所述PBS溶液的浓度为0.005
‑
0.015mol/L，所述PBS溶液的pH为7.3
‑
7.5。
[0020]在一可实施方式中，所述检测方法还包括：获得生物素修饰的OTA核酸适配体原液，加入0.005
‑
0.015mol/L的PBS溶液进行稀释，得到浓度为10
‑
500nmol/L的生物素修饰OTA核酸适配体；其中，所述PBS溶液的pH为7.3
‑
7.5。
[0021]在一可实施方式中，所述检测方法还包括：所述向封闭板孔加入生物素修饰的OTA核酸适配体，包括：向封闭板孔的每一孔中加入90
‑
110uL的所述生物素修饰的OTA核酸适配体；其中，所述OTA核酸适配体为激活Cas12a
‑
crRNA切割ssDNA
‑
FQ的ssDNA。
[0022]在一可实施方式中，所述CRISPR/Cas12a
‑
crRNA
‑
ssDNA
‑
FQ的混合物在NEBr2.1缓冲液中制备，所述NEBr2.1缓冲液由40
‑
60mmol/L的NaCl溶液、5
‑
15mmol/L的Tris
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种由CRISPR/Cas12a
‑
crRNA驱动的OTA检测方法，其特征在于，所述OTA检测方法包括以下步骤：向孔板的孔中加入链霉亲和素溶液，在3
‑
5℃下孵育15
‑
17h，洗板，得到链霉亲和素修饰的微孔板；向链霉亲和素修饰的微孔板的板孔中加入90
‑
110μL浓度为9
‑
11mg/mL的牛血清蛋白溶液封闭板孔，洗板，得到牛血清蛋白溶液封闭的微孔板；向牛血清蛋白溶液封闭的微孔板的板孔中加入生物素修饰的OTA核酸适配体，在20
‑
26℃下摇匀，洗板，得到OTA核酸适配体包被的孔板；在缓冲液中，将Cas12a和等量的crRNA在20
‑
27℃条件下孵育9
‑
11min，加入ssDNA
‑
FQ报告基因，混匀，得到Cas12a
‑
crRNA
‑
ssDNA
‑
FQ混合液；将待测原料粉碎后溶解、离心，收集上清液作为样品原液，过滤，稀释8
‑
11倍后获得样品待测液，向OTA核酸适配体包被的孔板的孔中分别加入90
‑
110μL样品待测液和对照品，孵育0.9
‑
1.5h，洗板，得到孵育了样品待测液和对照品的孔板；向孵育了样品待测液和对照品的孔板的孔中加入90
‑
110μLCas12a
‑
crRNA
‑
ssDNA
‑
FQ混合物，反应至90
‑
110min后，得到目标检测物；在λex＝590nm,λem＝620nm条件下，对目标检测物进行荧光检测，得到荧光信号；通过对比样品待测液的荧光信号值与对照品的荧光信号值判断样品待测液内是否存在OTA。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将所述样品待测液的荧光信号与对照品的荧光信号值进行比较，确定所述样品待测原料是否含有OTA，包括：若所述荧光信号低于对照品的荧光信号值，确定所述待测原料中含有OTA；若所述荧光信号不低于对照品的荧光信号值，确定所述待测原料中不含有OTA。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，OTA核酸适配体包被的孔板的孔中分别加入90
‑
110μL样品待测液、多组浓度为0.2
‑
1200pg/ml的OTA标准品、OTA浓度为0pg/ml的对照品，多组所述OTA标准品的浓度不同，用对照组的荧光信号值减去各OTA标准组的荧光信号值，得到各浓度标准组的荧光信号差值ΔI，绘制ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线；用对照组的荧光信号值减去样品待测液的荧光信号值，得到ΔI
样品
，将ΔI
样品
代入ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线，计算出样品待测液浓度的对数，求其反对数，再乘以8
‑
11倍得到待测样品中的OTA浓度。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述链霉亲和素溶液的添加量为90
‑
110μL，所述链霉亲和素溶液的浓度为1
‑
20μg/mL；所述链霉亲和素溶液的溶剂为碳酸钾溶液，所述碳酸钾溶液的浓度为0.05
‑
0.15mol/L，PH为9.5
‑
9.7。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述洗板操作为：采用190
‑
210μLPBS溶液进行洗板，所述PBS溶液的浓度为0.005
‑
0.015mol/L，所述PBS溶液的pH为7.3
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈思，潘柳妤，杨丹婷，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：