一种测定免疫动物体内抗原特异性抗体分泌B细胞频率的方法技术

本发明专利技术提供一种利用酶联免疫斑点测定来判断免疫动物体内抗原特异性抗体分泌B细胞频率的方法。该方法包括以下步骤：采集免疫动物的外周血，经离心分离得到记忆B淋巴细胞；记忆B细胞在细胞因子IL

【技术实现步骤摘要】
一种测定免疫动物体内抗原特异性抗体分泌B细胞频率的方法


[0001]本专利技术涉及免疫学
，具体地说是涉及一种利用ELISPOT测定动物体内抗原特异性抗体分泌B细胞频率的方法。

技术介绍

[0002]抗体效价也称为抗体滴度，是特异性抗体生物活性的重要标志，反应了特异性抗体与抗原的结合能力。抗体效价是疾病诊断、特异性免疫球蛋白制备和疫苗评价等领域的重要指标，对其检测在临床上意义重大。从细胞化学角度说，抗体效价指的是抗体在保持其最佳特异性染色，并且具备最小背景染色条件下的最高稀释倍数，也就是抗体识别特定抗原决定部位所需要的最低浓度。
[0003]抗体效价通常通过酶联免疫吸附测定（ELISA）法来检测，其实验原理为将血清样品先稀释一定倍数后，在酶标板中逐孔倍比稀释加样，采用常规ELISA方法检测，读取OD值。OD值高于空白对照2倍的孔判断为阳性，颜色最淡的一孔阳性孔的稀释倍数即为该血清样品中目的抗体效价比。目前常用的几种ELISA 方法有：间接法，双抗体夹心法和竞争法等。计算待检抗体与空白对照吸光度比（Positive/negative，P/N），当P/N大于2时为阳性，P/N小于2为阴性，取稀释倍数最大的阳性结果为测得的抗体效价。抗体效价通常用
ꢀ“
1：X
”ꢀ
的形式表示（X表示抗体可以被检测出来的最大稀释倍数），例如抗体效价为1:32000，就表示抗体被稀释到32000倍仍可以检测出来，再稀释就无法检测。X的数值越大，抗体效价越大，表示抗体与抗原结合能力越强。
[0004] 监测免疫后产生的 B 细胞反应的传统方法是通过 ELISA 测量血清中的特异性抗体滴度。然而，血清中的抗体水平不提供有关 抗体分泌细胞 (ASC)数量、记忆 B 细胞反应和免疫反应状态（例如对抗原无反应）的信息。处于静止状态时，记忆 B 细胞的存在无法通过 ELISA 确定。免疫动物通常会诱导由循环抗原特异性记忆 B 细胞介导的长期保护作用，这些细胞不会离体自发产生抗体。具有较长寿命的记忆 B 细胞在重新暴露于特定抗原后的快速反应中起着核心作用。静止记忆 B 细胞在体内不会产生大量抗体，需要抗原刺激才能分化为 ASC。激活这些记忆 B 细胞需要在高细胞密度（>10
6 个细胞/孔/ml）和适当的刺激下进行2
‑
5 天的体外预孵育实现。酶联免疫斑点测定（Enzyme Linked Immunospot Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏的广泛使用的监测免疫反应的方法，用于在体外适当刺激后对细胞因子或抗体分泌细胞进行定量（Cox et al 2006年）。 一般，如果释放出一种特征性的蛋白质，并且有识别蛋白质的特异性高亲和力抗体可用，则可以通过 ELISPOT 检测每个细胞。B 细胞 ELISPOT 检测是鉴定和确定ASC 数量以及定量外周血循环中记忆 B 细胞频率的首选方法。B 细胞 ELISPOT 测定的一个主要优点是它能够激活离体抗原特异性记忆 B 细胞，然后对其进行测量。
[0005]ELISPOT 测定与ELISA 相当，并且基于相同的免疫化学原理。 主要区别在于 ELISPOT 是免疫测定和生物测定的结合，因为活细胞直接在 ELISPOT 板的孔中培养。首
先，将对目的蛋白具有特异性的抗体包被在固相（96 孔板）上。 随后将免疫细胞（例如 PBMC 或活化的 B 细胞）添加到96孔板中，并在存在或不存在细胞刺激因子（IL
‑
2和R848）或抗体分泌的刺激物的情况下孵育。 释放的蛋白质被包被抗体捕获在直接围绕生产细胞的区域。 在清洗孔以去除免疫细胞后，包被抗体捕获的任何细胞因子或抗体都保留在孔中。 然后通过第二特异性检测抗体、偶联物和沉淀底物的组合使捕获的蛋白质可视化。单个细胞在孔底部形成一个彩色“足迹”（点），代表其分泌活动。点形成细胞的频率可以从孔中的点数和细胞输入中量化。术语“斑点形成细胞”用作 ELISPOT 测定中细胞因子或抗体分泌细胞数量的定量测量。ELISPOT可以在单细胞水平对抗体分泌细胞及细胞因子分泌细胞进行检测，比ELISA和有限稀释法等具有更髙的灵敏性（一般高100
‑
400倍），能从10万
‑
30万细胞中检岀1个分泌该蛋白的细胞。该方法能够对抗原刺激后的活细胞进行功能性检测，具有较髙的特异性、直观可信度髙、易操作。
[0006]通常我们选择具有最佳效价的老鼠或兔子去做细胞融合产生单克隆抗体，但有时这些动物不会产生任何阳性克隆或仅产生很少的阳性克隆。 原因是这些动物的脾脏中只有少量分泌特异性抗体的 B 细胞，它们显示出超高的效价，但因为这些特异性B细胞数量太少，导致与骨髓瘤细胞成功融合的概率太低。传统的ELISA法仅测定分泌抗体的总浓度（即效价），无法测定动物体内的分泌特异性抗体的B细胞数量或比例。因为肠系膜淋巴结、外周血和脾脏中含有大致相等百分比的 B 细胞。因此，可以通过对外周血中抗原特异性B细胞频率进行测定以得到脾脏中抗原特异性B细胞的频率，从而在杂交瘤抗体或重组抗体制备前选择最合适的动物。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是找到一种快速高效测定动物体内抗原特异性抗体分泌B细胞的频率的方法。
[0008]为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种简单、方便、低成本的方法。该方法包括以下步骤：（1）采集免疫动物的外周血，经离心分离得到外周血单个核细胞（如记忆B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞）；（2）记忆B细胞在细胞因子 IL
‑
2 和 R848 刺激下扩增2
‑
5天；（3）活化 B 细胞释放的抗体被ELISPOT板底聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上预包被的二抗（ELISPOT板1）捕获；（4）去除细胞后，被捕获的抗体与生物素标记的二抗结合（ELISPOT板1）或者生物素标记的抗原结合（ELISPOT板2），最后再与酶标记的链霉亲和素结合；（5）ELISPOT板加入底物后，PVDF膜上出现的斑点表明B淋巴细胞产生了抗体，对斑点进行计数和分析；（6）计算ELISPOT板2和ELISPOT板1的斑点数的比值。比值高的动物被选中进行下一步的抗体制备。
[0009]本专利技术中，步骤（1）所述“免疫动物”包括各种品系小鼠、大鼠和兔子。
[0010]其中，步骤（3）所述“二抗”包括但不限于全长羊抗鼠IgG，全长羊抗兔IgG，Fab形式的羊抗鼠IgG，Fab形式的羊抗兔IgG等。
[0011]其中，步骤（4）所述“酶”包括辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶等（AP）等。
[0012]其中，步骤（5）所述“底物”包括但不限于各种比色底物如TMB，pNPP，AEC，荧光底物等。
附图说明
[0013]图1是测定免疫动物体内抗原特异性抗体分泌B细胞频率的流程图。
实施方式
[0014]以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本专利技术而不限于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用酶联免疫斑点测定来判断免疫动物体内抗原特异性抗体分泌B细胞频率的方法，其特征在于包含以下步骤：（1）采集免疫动物的外周血，经离心分离得到外周血单个核细胞，如记忆B淋巴细胞；（2）循环记忆B淋巴细胞在细胞因子 IL
‑
2 和 R848 刺激下扩增2
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5天；（3）活化 B 细胞释放的抗体被ELISPOT板底聚偏二氟乙烯膜上预包被的二抗捕获；（4）去除细胞后，被捕获的抗体与生物素标记的二抗结合（ELISPOT板1）或者生物素标记的抗原结合（ELISPOT板2），最后再与酶标记的链霉亲和素结合；（5）...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昀昀，安妮塔，
申请(专利权)人：北京美德泰康生物科技有限公司罗昀昀，
类型：发明
国别省市：