使用包埋介质的组织样品光学透明化方法技术

本发明专利技术涉及一种用于制备用于光学显微镜检查的生物或人体组织的透明组织样品的方法，具有以下步骤：a)使用脱水溶剂对组织样品进行脱水，以及b)通过将脱水后的组织样品转移到含有苯甲醛茴香醚的包埋介质内来使其透明化。与迄今为止通常用作包埋介质的苯甲酸苄酯/苯甲醇混合物和水杨酸甲酯

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用包埋介质的组织样品光学透明化方法
[0001]本专利技术涉及根据权利要求1的前序部分所述的方法，如权利要求10所述的用于制备生物组织样品的试剂盒，以及如权利要求13所述的应用。
[0002]为了使组织样品能够进行三维成像，例如通过光片显微术，需要透明的生物组织样品。在生物制剂中获得透明性需要从生物制品中除去特别是血色素血红蛋白的血红素基团和脂质。在“脱水”过程中，用可与水混溶的有机溶剂和水的各种混合物处理组织。为了从组织中完全除去水，用递增比例的有机溶剂进行处理。这里有许多选择，例如四氢呋喃、甲醇、异丙醇、叔丁醇和乙醇。乙醇是目前最常用的在病理学中使组织透明化的脱水介质。所有“脱水”过程的最终结果是无水样品。
[0003]各种透明化方法中的最后步骤是将折射率调节到进行显微术的组织的折射率。根据Spalteholz(“das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen”[On the transparency of human and animal preparations],S.Hirzel发表,1911,德国专利229044号)，脱水组织的折射率对于骨为n＝1.547。基于他凭经验确定的最佳混合物，其他组织的折射率可以估计为约n＝1.551。这种高折射率需要使用通常与水不混溶的芳族化合物。对于他的研究，Spalteholz使用冬青油(水杨酸甲酯)和苯甲酸苄酯或异黄樟素的混合物，其混合比例根据各种组织定制。
[0004]可从Dodt，Leischner，Schierloh，Mauch，Deininger，Deussing，Eder，和Becker的“Ultramicroscopy:three
‑
dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain”中了解Spalteholz方法的一种变体，其中使用“Murray透明剂”(苯甲酸苄酯和苄醇的2：1混合物，折射率n＝1.559)作为包埋介质。从Becker,Saghafi,Weiler和Dodt“Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains”(2012)PLoS ONE 7(3):e33916.https://doi.org/10.1371/journal.pone.003391中可知另一种变体。Spalteholz包埋介质和许多其它芳族化合物进行了测试。二苯甲基醚(DBE，折射率n＝1.562)作为最适合的化合物出现并且已经成为组织透明化中的事实上的金标准。DBE的优点还在于其易于使用，因为不需要将溶液混合然后检查其折射率；它可以以纯物质的形式直接使用。
[0005]从WO 2017/093323A1中已知有使用肉桂酸乙酯(ECi)和相关的肉桂酯作为当时的常用的包埋介质的无毒替代物。它表现出比用于组织处理的其它芳族化合物例如二苯甲基醚、苄醇或苯甲酸苄酯更低的急性和慢性毒性。由于作为纯物质它实现了所需的折射率，因此消除了混合步骤，从而消除了工作步骤和可能的误差源。
[0006]因此，适合作为脱水样品包埋介质的纯液体物质的选择目前限于两种化合物，二苯甲基醚和肉桂酸乙酯。然而，两种物质都有缺点：二苯甲基醚是有毒的。虽然肉桂酸乙酯具有低毒性，但其熔点为6℃至9℃，因此用肉桂酸乙酯透明化的样品不能储存在冰箱中，因为包埋介质将在其中结晶。肉桂酸乙酯还具有相对较高的蒸气压。
[0007]本专利技术的目的是提供一种制备用于光学显微镜检查的生物组织的透明组织样品的方法，该方法克服了上述缺点，并且特别地涉及相比必须产生作为包埋介质的混合物而
更省力，避免了具有高毒性的包埋介质，并且允许脱水组织样品的冷藏储存。
[0008]根据本专利技术，该目的通过如权利要求1所述的方法来实现。该目的还通过如权利要求9所述的试剂盒和如权利要求11所述的应用来实现。
[0009]其它的实施方式是从属权利要求或下文描述的主题。
[0010]根据本专利技术的用于制备用于光学显微镜检查的生物组织的透明组织样品的方法包括以下步骤：
[0011]a)用脱水溶剂使组织样品脱水，和
[0012]b)通过将脱水的组织样品置于具有与该组组相匹配的折射率包埋介质中使脱水的组织样品透明化。
[0013]所述包埋介质包含苯甲醛茴香醚，优选选自3
‑
甲氧基苯甲醛、4
‑
甲氧基苯甲醛、2
‑
羟基
‑5‑
甲氧基苯甲醛和4
‑
乙氧基苯甲醛。
[0014]根据本专利技术的方法的目的是在用于光学显微镜的生物或人组织样品中实现光学透明度。生物组织例如是人组织或动物组织。
[0015]透明化方法的透明化步骤是将折射率调节为进行显微术的组织的折射率。为此，将组织样品转移到用于调节折射率的溶液中：包埋介质。包埋介质必须与脱水步骤中使用的溶剂混溶。
[0016]在一个实施方式中，包埋介质含有10体积％至100体积％的苯甲醛醚和0体积％至90体积％的折射率为约1.3、优选约1.5的光学上合适的惰性有机溶剂。例如，包埋介质含有90体积％至100体积％的苯甲醛醚。
[0017]在另一个实施方式中，包埋介质含有10体积％至100体积％的苯甲醛醚和0体积％至90体积％的折射率为约2.0、优选约1.65的光学上合适的惰性有机溶剂。例如，包埋介质含有90体积％至100体积％的苯甲醛醚。
[0018]本专利技术所述的所有百分比是体积百分比(体积％)。
[0019]在优选的实施方式中，包埋介质由本专利技术的苯甲醛茴香醚组成，即苯甲醛茴香醚作为纯物质使用。纯物质在此被理解为指具有工业上可获得的纯度的苯甲醛茴香醚。
[0020]苯甲醛醚是苯甲醛茴香醚。苯甲醛茴香醚优选选自3
‑
甲氧基苯甲醛(间
‑
茴香醛；CAS编号591
‑
31
‑
1)、4
‑
甲氧基苯甲醛(对茴香醛；CAS编号123
‑
11
‑
5)、2
‑
羟基
‑5‑
甲氧基苯甲醛(6
‑
羟基
‑
间茴香醛；CAS编号672
‑
13
‑
9)和4
‑
乙氧基苯甲醛(homoanisaldehyde；CAS编号10031
‑
82
‑
0)。作为工业产品的3
‑
甲氧基苯甲醛具有约97.0％的纯度。作为工业产品的4
‑
甲氧基苯甲醛具有约97.0％的纯度。作为工业产品的2
‑
羟基
‑5‑
甲氧基苯甲醛具有约98.0％的纯度。作为工业产品的4
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乙氧基苯甲醛具有约99％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备用于光学显微镜检查的生物组织的透明组织样品的方法，该方法包括以下步骤：a)用脱水溶剂使组织样品脱水，和b)通过将脱水的组织样品置于包埋介质中使脱水的组织样品透明化，所述包埋介质包含选自3
‑
甲氧基苯甲醛、4
‑
甲氧基苯甲醛、2
‑
羟基
‑5‑
甲氧基苯甲醛和4
‑
乙氧基苯甲醛的苯甲醛茴香醚。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包埋介质含有10体积％至100体积％的所述苯甲醛茴香醚和0体积％至90体积％的折射率为约1.3、优选1.5的光学上合适的惰性有机溶剂。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包埋介质含有10体积％至100体积％的所述苯甲醛茴香醚和0体积％至90体积％的折射率为约2.0、优选1.65的光学上合适的惰性有机溶剂。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述包埋介质由选自3
‑
甲氧基苯甲醛、4
‑
甲氧基苯甲醛、2
‑
羟基
‑5‑
甲氧基苯甲醛和4
‑
乙氧基苯甲醛的苯甲醛茴香醚组成。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，脱水步骤a)包括使用由水性醇、酮或醚组成的脱水组合物，并且所述脱水组合物是醇、酮或醚的水性混合物，其中所述脱水组合物的溶剂浓度为50体积％至98体积％、优选70体积％至98体积％、更优选75体积％至98体积％，优选为具有递增的乙醇浓度的水性乙醇的水性混合物，所述脱水组合物的乙醇浓度为50体积％至98体积％。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，脱水步骤a)在梯度混合器中进行，并且所述组织样品在所述脱水步骤开始时被直接引入溶剂浓度为50体积％的脱水溶剂中，然后以小增量增加所述梯度。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a)中脱水并且在步骤b)中光学透明化之前，所述组织样品
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经固定和/或
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用甲醛固定和/或
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经洗涤和/或
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用水洗涤和/或
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在碱性水溶液中温育和/或
·
用洗涤剂溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：摩比空公司，
类型：发明
国别省市：