一种检测mRNAPoly(A)尾长度的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测mRNA Poly(A)尾长度的方法，属于生物技术领域。用具有非腺嘌呤核苷酸（U、C、G）酶切位点的RNA水解酶酶切待测mRNA，得到mRNA的Poly(A)尾序列片段和其他酶切小片段的水解产物，对水解产物中的Poly(A)尾序列用Oligo(dT)

【技术实现步骤摘要】
一种检测mRNA Poly(A)尾长度的方法


[0001]本专利技术涉及一种利用毛细管电泳技术准确、批量检测mRNA Poly(A)尾长度的方法，属于生物
，适用于涉及有mRNA Poly(A)尾长度检测需求的基础研究和质量控制检测。

技术介绍

[0002]mRNA疫苗是mRNA技术在过去30年中取得飞速发展的真实见证。辉瑞/BioNTech和Moderna开发的两种最成功COVID
‑
19mRNA疫苗的基础是体外转录(In vitro transcription，IVT)的mRNA。通常IVT mRNA由一个单链的开放阅读框(Open reading frame，ORF)为核心，两侧是两个非翻译区(untranslatedregion，UTR)，分别是5
’
UTR和3
’
UTR，在5
’
/3
’
端含有对mRNA稳定性和翻译效率具有重要作用的转录后修饰：5
’
帽子和3
’
Poly(A)尾。/>[0003]3’本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测mRNA Poly(A)尾长度的方法，其特征在于包括下列步骤：（1）用具有非腺嘌呤核苷酸（U、C、G）酶切位点的RNA水解酶，酶切待测mRNA，获得mRNA的Poly(A)尾序列片段和其他酶切小片段的水解产物；（2）将步骤（1）中的水解产物加热至65 ℃，孵育2分钟，以破坏二级结构，然后将水解产物置于冰上2
‑
10分钟；（3）将步骤（2）的水解产物平衡至室温，用Oligo(dT)
n
磁珠捕获步骤（2）水解产物中的Poly(A)尾序列；（4）将步骤（3）获得的Poly(A)尾序列
‑
磁珠复合物加热变性，使Poly(A)尾序列从磁珠上解离下来，收集解离下来的Poly(A)尾片段；（5）将步骤（4）收集的Poly(A)尾片段，利用毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）获得mRNA的Poly(A)尾序列图谱；（6）通过添加核酸内标，利用CE获得核酸内标图谱，使用R语言拟合核酸内标长度（nt）与保留时间（min）的标准曲线方程，基于拟合的标准曲线方程获得mRNA的Poly(A)尾序列长度及其分布。2.根据权利要求1所述的检测mRNA Poly(A)尾长度的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的RNA水解酶为：仅具有酶切RNA分子5
’
/ 3
’
端鸟嘌呤（G）、5
’
/ 3
’
端胞嘧啶（C）或者5
’
/ 3
’
端尿嘧啶（U）的特性中至少一种的RNA水解酶；所述鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、尿嘧啶（U）依据待测mRNA序列中实际组成的未修饰/修饰的核苷酸类型，选择合适的RNA水解酶。3.根据权利要求2所述的检测mRNA Poly(A)尾长度的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的RNA水解酶为具有酶切RNA分子3
’
端鸟嘌呤（G）的RNase T1，用该RNase T1酶切待测mRNA，获得mRNA的Poly(A)尾序列片段、3
’‑
GMP和含3
’‑
GMP末端的寡核苷酸序列片段；用RNase T1水解RNA的浓度≥25 U/μg，酶切反应时间：10
‑
15分钟。4.根据权利要求1所述的检测mRNA Poly(A)尾长度的方法，其特征在于：所述步骤（3）的Oligo(dT)
n
中，n≥15 nt，通过磁吸方式捕获或固定磁珠，包含但不限于使用磁力架或自动化核酸提取仪的磁头；所述步骤（4）的加热变性是在65
‑
100 ℃下热变性2
‑
8分钟；所述步骤（1）
‑
（4）利用自动核酸提取仪进行自动化处理，或者采用人工处理；利用自动核酸提取仪进行自动化处理能够减少人为手动操作产生的批间差异，获得质量稳定、可供检测用m...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢忠平，向虹，陈昶旭，洪超，田原，廖国阳，谢天宏，高羽，岳磊，李华，戴永娟，余娜，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：