一种利用冻精管冻存生物细胞的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，其特征在于：具体包括以下具体步骤：(1)收集培养的生物细胞，(2)冻精管的灌装与密封，(3)细胞冻存程序，(4)细胞复苏培养。本发明专利技术具有的优点是：采用本发明专利技术的技术方案可以使用冻精管进行少量生物细胞的保存，并保证冻存细胞的复苏活性达到与手动冻存相近的程度，具有极大的推广价值。具有极大的推广价值。具有极大的推广价值。

【技术实现步骤摘要】
一种利用冻精管冻存生物细胞的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种利用冻精管冻存生物细胞的方法。

技术介绍

[0002]我国具有丰富的畜禽品种资源，不但有世界著名高产品种引进，还有大量适应性强、生产性能高的优良地方品种。由于发展滞后，我国地方品种资源尚未得到足够的重视，在自身利用中也存在一定问题，使得地方品种优势呈现逐渐衰减的趋势，急需保护和保存。生物样本保存是种质资源保存的一个重要方法，其中培养生物细胞冷冻保存可为种质资源研究、克隆复苏种群提供材料，是一种高效率、低成本的保存方法。然而，由于遗传物质在传至一定代数后会发生癌变，可作为种质资源备份的生物细胞并不能长期培养传代。目前，冻存生物细胞的方法主要有机器冷冻、程序冻存盒冻存、手动冻存三种。机器冻存需要用到特定仪器，以精液和人类胚胎为主，常见于医院等物质条件更为丰富的场所；程序冻存盒操作简单、条件要求不高，应用范围较广；手动冻存条件要求最低，应用范围极广。在常见的冻存方法中，冻存管容量为2.0mL，所含细胞数量远超体细胞克隆等实验需求，多出的细胞如果继续培养冻存，多代后将无法适应实验需求，造成样本资源的浪费。而冻精管容量为300
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400μL，更适合一般实验用量。因此，有必要开发一种利用冻精管保存生物细胞的方法，以避免珍稀样本的浪费。

技术实现思路

[0003]本专利技术的专利技术目的在于提供一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，所述的冻存方法可以使用冻精管进行少量生物细胞的保存，并保证冻存细胞的复苏活性达到与手动冻存相近的程度，具有极大的推广价值。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0005]一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，具体包括以下具体步骤：
[0006](1)收集培养的生物细胞：
[0007]当细胞生长至70％～80％融合度时准备消化冻存，用移液器沿培养皿边缘移除培养液，加入含双抗的DMEM清洗1次，移除DMEM，加入100～500μl1％胰蛋白酶，镜下观察细胞形态变圆或肉眼观察到细胞成片脱离培养皿壁后，加入完全培养基终止消化，吹打均匀后1000rpm离心3min，弃上清，加入细胞冻存液重悬；
[0008](2)冻精管的灌装与密封：
[0009]用1mL移液枪取350μl混匀的细胞液，从无棉塞的一侧注入冻精管，微微倾斜冻精管，使液体流动至冻精管中部，两端留出1～1.5cm；使用止血钳将无棉塞的一侧冻精管约0.5cm长度夹扁，将止血钳置于酒精灯上灼烧约2～3s，从已夹扁的冻精管中部向管口夹持冻精管约1～3s，观察冻精管是否被烫坏；重复灼烧、夹持动作1～2次，倾斜冻精管，观察液体是否流动，调整封口直到液体不流动为止；
[0010](3)细胞冻存程序：
[0011]将灌装密封后的细胞进行冻存，冻存按照以下步骤进行：4℃、10～15min，
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20℃、30min，
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80℃、360～380min，转移至液氮中长期保存；
[0012](4)细胞复苏培养：
[0013]从液氮中取出冻精管，置于38℃水浴解冻30s；解冻后的冻精管用酒精棉球消毒其中一头，观察是否有漏液现象；在无菌环境下，剪开冻精管已消毒的一头，将冻精管垂直立于离心管管口上方，剪开另一头，使液体流入离心管中，1500～3000rpm离心5min，弃上清，加入培养基吹打重悬，重复离心1次，弃上清，加入培养基吹打重悬，转移至培养皿或培养瓶中按一般细胞培养要求培养。
[0014]进一步说明，步骤(1)中，所述细胞为293T细胞、水牛骨骼肌成纤维细胞或其他动物组织细胞。
[0015]进一步说明，步骤(1)中，所述完全培养基为90mLDMEM高糖培养基+10mLFBS胎牛血清+1万U青链霉素。
[0016]进一步说明，步骤(1)中，所述细胞冻存液为所述完全培养基90mL+DMSO二甲基亚砜10mL或所述完全培养基80mL+DMSO二甲基亚砜20mL。
[0017]进一步说明，步骤(2)中，所述冻精细管为富士平冻精细管、卡苏牛冻精细管。
[0018]优选的，步骤(3)中，所述细胞冻存程序：将灌装密封后的细胞进行冻存，冻存按照以下步骤进行：4℃、10min，
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20℃、30min，
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80℃、360min，转移至液氮中长期保存。
[0019]由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
[0020]1、本专利技术采用冻精管对生物细胞进行保存，相比于传统冻存管，具有容量小、污染少、随取随用、操作简便的优点。同时，冻精管冷冻细胞还可以适应需求量较少的实验，对于不需要大批量培养细胞的实验，使用冻精管冷冻细胞可以避免造成浪费。对于采样难度极大的原代生物细胞，冻精管冷冻细胞可以限制取用数量，避免细胞因多次传代造成的遗传变异，使珍稀样本得到更充分的利用。
[0021]2、本专利技术针对冻精管进行了手动冻存细胞程序的调整，对适用于2.0ml冻存管的冻存程序(4℃15min，
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20℃60min，
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80℃12h)进行了调整，新的冻存程序(4℃10min，
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20℃30min，
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80℃360min)更适应冻精管，能够保证冻存细胞的活力，同时节省了降温时间。
[0022]综上，本申请人研究的方案冷冻的293T细胞可以在48h内增殖至60％
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70％密度，且对细胞损害最小。
附图说明
[0023]图1是实施例1中A组培养293T细胞24h后生长状况图；
[0024]图2是实施例1中B组培养293T细胞24h后生长状况图；
[0025]图3是实施例1中A组培养293T细胞48h后生长状况图；
[0026]图4是实施例1中B组培养293T细胞48h后生长状况图；
[0027]图5是实施例2中培养293T细胞12h后生长状况图；
[0028]图6是实施例2中培养293T细胞24h后生长状况图；
[0029]图7是实施例2中培养293T细胞48h后生长状况图；
[0030]图8是实施例3中10C组培养293T细胞12h后生长状况图；
[0031]图9是实施例3中101组培养293T细胞12h后生长状况图；
[0032]图10是实施例3中20C组培养293T细胞12h后生长状况图；
[0033]图11是实施例3中201组培养293T细胞12h后生长状况图；
[0034]图12是实施例3中10C组培养293T细胞24h后生长状况图；
[0035]图13是实施例3中101组培养293T细胞24h后生长状况图；
[0036]图14是实施例3中20C组培养293T细胞24h后生长状况图；
[0037]图15是实施例3中201组培养293T细胞24h后生长状况图。
具体实施方式
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，其特征在于：具体包括以下具体步骤：(1)收集培养的生物细胞：当细胞生长至70％～80％融合度时准备消化冻存，用移液器沿培养皿边缘移除培养液，加入含双抗的DMEM清洗1次，移除DMEM，加入100～500μl1％胰蛋白酶，镜下观察细胞形态变圆或肉眼观察到细胞成片脱离培养皿壁后，加入完全培养基终止消化，吹打均匀后1000rpm离心3min，弃上清，加入细胞冻存液重悬；(2)冻精管的灌装与密封：用1mL移液枪取350μl混匀的细胞液，从无棉塞的一侧注入冻精管，微微倾斜冻精管，使液体流动至冻精管中部，两端留出1～1.5cm；使用止血钳将无棉塞的一侧冻精管约0.5cm长度夹扁，将止血钳置于酒精灯上灼烧约2～3s，从已夹扁的冻精管中部向管口夹持冻精管约1～3s，观察冻精管是否被烫坏；重复灼烧、夹持动作1～2次，倾斜冻精管，观察液体是否流动，调整封口直到液体不流动为止；(3)细胞冻存程序：将灌装密封后的细胞进行冻存，冻存按照以下步骤进行：4℃、10～15min，
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20℃、30min，
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80℃、360～380min，转移至液氮中长期保存；(4)细胞复苏培养：从液氮中取出冻精管，置于38℃水浴解冻30s；解冻后的冻精管用酒精棉球消毒其中一头，观察是否有漏液现象；在无菌环境下，剪开冻精管已消毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：于农淇，梁莎莎，李厅厅，鄢胜飞，卢瑛，覃广胜，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水牛研究所，
类型：发明
国别省市：