本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及酵母菌和益生菌复合溶胞物的制备方法及其在化妆品行业领域的应用。本发明专利技术将奇异酵母用在短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及长双歧杆菌增殖中，并以四种菌体的溶胞物作为组合物，组合物中奇异酵母溶胞物的添加量为组合物的45％
【技术实现步骤摘要】
rhamnosus)，菌种保藏号CICC 20257；长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)菌种保藏号GDMCC 1.263。
[0011]上述技术方案中，进一步地，奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)溶胞物的添加量为组合物质量的45％
‑
79％；短乳杆菌(Lactobacillus brevis)溶胞物的添加量为组合物质量的1％
‑
10％；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)溶胞物的添加量为组合物质量的5％
‑
20％；长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)溶胞物的添加量为组合物质量的15％
‑
25％。
[0012]上述技术方案中，进一步地，所述组合物中各菌体溶胞物的制备方法包括以下步骤：(1)菌体的培养：各菌体经平板培养活化，挑取单菌落制得一级种子液，再进行扩大培养，得菌体发酵液；奇异酵母培养基为麦芽汁肉汤培养基，短乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的培养基为MRS培养基，长双歧杆菌的培养基为BBL培养基；
[0013](2)将步骤(1)得到的发酵混合物进行离心，得菌体沉淀，加入蒸馏水混合均匀，经超声破碎后，将混合物进行离心，得到细胞溶胞物，冷冻干燥备用；
[0014]优选地，短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌溶胞物的制备方法如下步骤：
[0015](1)短乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的MRS培养基成分及其添加比例为：蛋白胨1％、牛肉浸提物1％、酵母提取物0.5％、葡萄糖2％、醋酸钠0.5％、柠檬酸二胺0.2％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.005％、吐温0.1％；长双歧杆菌的BBL培养基成分及其添加比例为：蛋白胨1％、牛肉浸提物1％、酵母提取物0.5％、葡萄糖0.5％、磷酸氢二钾0.045％、磷酸二氢钾0.033％、氯化铵0.1％、硫酸镁0.01％、L
‑
半胱氨酸0.05％、硫化钠0.05％、刃天青0.0001％；
[0016](2)菌体培养方法为：菌体在37℃培养箱中，平板静置培养20
‑
24h，注意长双歧杆菌是在厌氧培养箱中进行培养；挑取单菌落接至10mL液体培养基中，37℃培养20
‑
24h，获得一级种子液；种子液按1％的接种量接至液体培养基中，并接入30
‑
300ml奇异酵母发酵液，至1L体系，37℃培养24h，得到菌体发酵液；
[0017](3)将得到的发酵混合物进行离心，8000rpm/10min，得菌体沉淀；
[0018](4)将菌体沉淀加水混合均匀，进行超声破碎，超声破碎的条件为：功率300W，工作5s，停顿15s，工作时长10min，共超声两次；
[0019](5)将制得细胞溶出物进行离心，8000rpm/10min，去掉细胞壁，得到细胞溶胞物；
[0020](6)将得到的溶胞物进行冻干处理，冷冻温度：
‑
40℃至
‑
60℃，真空度1Pa
‑
8Pa，冷冻干燥时间为24h
‑
36h。
[0021]优选地，在短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及长双歧杆菌的扩大培养阶段加入奇异酵母发酵液或奇异酵母胞外多糖；
[0022]优选地，奇异酵母溶胞物的制备方法如下步骤：
[0023](1)奇异酵母的麦芽汁肉汤培养基成分及其添加比例为：酵母膏0.3％，麦芽提取物0.3％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％；
[0024](2)菌体培养方法为：菌体在28℃培养箱中，平板静置培养24
‑
48h；挑取单菌落接至10mL液体培养基中，28℃培养24
‑
48h，获得一级种子液；种子液按1％的接种量接至1L液体培养基中，28℃培养48h，得到菌体发酵液；
[0025](3)将得到的发酵混合物进行离心，8000rpm/10min，得菌体沉淀和发酵液；
[0026](4)将菌体沉淀加水混合均匀，进行超声破碎，超声破碎的条件为：功率300W，工作5s，停顿15s，工作时长10min，共超声两次；
[0027](5)将制得细胞溶出物进行离心，8000rpm/10min，去掉细胞壁，得到细胞溶胞物；
[0028](6)将得到的溶胞物进行冷冻干燥处理，冷冻温度：
‑
40℃至
‑
60℃，真空度1Pa
‑
8Pa，冷冻干燥时间为24h
‑
36h。
[0029]优选地，奇异酵母胞外多糖的制备方法如下步骤：
[0030](1)将上述步骤(3)得到的奇异酵母发酵液进行浓缩，并透析，然后进行冷冻干燥处理。称取适当干粉，用蒸馏水溶解；
[0031](2)采用苯酚
‑
硫酸法测定奇异酵母胞外多糖含量。苯酚
‑
硫酸法指浓硫酸将多糖或寡糖水解为单糖，并使得单糖迅速脱水为糠醛衍生物，在强酸条件下糠醛衍生物可与苯酚发生显色反应，生成的橙黄色物质在490nm处有最大吸收值。由于吸光值与多糖浓度在一定浓度范围内成线性关系，故可用比色法测定多糖含量。
[0032](3)将浓缩并透析后的奇异酵母发酵液中加入4倍体积的100％乙醇，4℃静置过夜，然后进行离心，10000rpm/20min，收集沉淀，并进行冷冻干燥处理；
[0033](4)将所得干粉加入蒸馏水复溶，与Sevage试剂按照体积比1：1进行混合，震荡反应20min后进行离心，4000rpm/10min，然后小心吸取上层溶液。将得到的溶液进行旋蒸除去有机溶剂，随后进行冷冻干燥处理，得到胞外多糖干粉。
[0034]本专利技术还提供了前述组合物在护肤品中的应用；优选地，所述应用于护肤品的功效物质为菌体细胞溶胞物。
[0035]上述技术方案中，进一步地，前述溶胞物在减少皮肤水分流失、增强皮肤弹性、增加皮肤厚度、缩小皮肤毛孔、减少皮肤皱纹、改善皮肤敏感方面的应用。
[0036]与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
[0037](1)本专利技术利用奇异酵母发酵产生的胞外多糖，促进短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及长双歧杆菌的增殖，不仅节约了发酵成本，还可以高效利用酵母发酵产物中的胞外多糖，减少资源浪费。(2)本专利技术将奇异酵母、短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及长双歧杆菌的溶胞物组合，制备中以奇异酵母促进其他菌体的增殖，混合后的溶胞物，功效更加全面，解决了现有益生菌护肤品的局限性，可以更好的提升肌肤紧致度，强化皮肤屏障。经实验结果可以得到，使用复合菌体溶胞物的化妆品后，皮肤经皮水分流失降低14.9
‑
18.7％；皮肤弹性升高10.7
‑
15.4％；皮肤厚度增加11.3
‑
16.8％；皮肤毛孔缩小了12.4
‑
17.1％；肌肤皱纹减少9.8
‑
12.6％；皮肤敏感度降低13.8
‑
17.9％本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.奇异酵母在促进短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及长双歧杆菌增殖中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述奇异酵母菌(Saccharomyces paradoxus)，其保藏编号为：CGMCC 2.5026；所述短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，其保藏编号CGMCC 8581；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，其保藏编号CICC 20257；长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其保藏编号GDMCC 1.263。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌的培养基中加入所述奇异酵母的发酵液；所述奇异酵母发酵液的添加量为培养基总量的3～30％，其中，奇异酵母胞发酵液中胞外多糖含量为25
‑
35％。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌的培养基中加入所述奇异酵母的胞外多糖，奇异酵母胞外多糖的添加量为培养基总量的1％
‑
8％。5.一种复合溶胞物组合物，其特征在于，包括菌体细胞溶胞物，所述菌体包括权利要求2所述奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)溶胞物的添加量为组合物的45％
‑
79％；短乳杆菌(Lactobacillus brevis)溶胞物的添...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹恒，刘明辉，张卉妍，朱佳佳，
申请(专利权)人：上海麦璞医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。