一种猪氟烷基因快速分型试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种猪氟烷基因快速分型试剂盒及其检测方法，涉及生物技术领域。本发明专利技术试剂包括引物预混液、探针法荧光定量PCR预混液和ddH2O。本发明专利技术方法通量大，一次可以同时对96个或者384个样本进行基因分型检测，适用于猪氟烷基因的大规模筛查，特别适用于大中型商业猪场。业猪场。业猪场。

【技术实现步骤摘要】
一种猪氟烷基因快速分型试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及猪氟烷基因快速分型试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]氟烷基因(HaΙ)又称骨骼肌钙离子释放通道基因或兰尼定受体基因(RYR1)，由一对等位基因HaΙN和HaΙn组成，并构成HaΙNN(野生型)、HaΙNn(杂合型)和HaΙnn(突变型)3种基因型，是导致猪应激综合征(Porcine stress syndrome，PSS)的主效基因。该基因定位在猪染色体6p11
‑
q21上，它是由RYR1中C1843突变为T1843，使受体蛋白第615位精氨酸变成了半胱氨酸，引起结构与功能的改变。当应激因子作用时，Ca2+大量非正常释放，引起肌肉持续收缩，从而产生PSS，其表现为呼吸急促、心跳加快、肌肉僵直、后肢呈现痉挛性收缩，甚至死亡，屠宰后产生PSE(Pale，soft，exudative)肉或DFD(Dark，firm，dry)肉，给养殖业造成巨大经济损失。据研究，氟烷基因阳性纯合子猪(nn)，即使采用最优处理条件，其产生PSE肉的比率也高达80％以上。杂合子猪(Nn)产生各种劣质肉的比率达到36.8％，显著高于阴性纯合子(NN)22.5％的水平。因此，需要通过检测来分辨并剔除猪群中氟烷基因的HaΙn基因，以避免猪应激综合症的产生。
[0003]目前检测猪氟烷基因的方法主要有生理、生化和分子生物学检测。生理检测是使幼猪吸入一定浓度的氟烷气体被麻醉后，表现出肌肉痉挛、四肢僵直的为氟烷阳性(HaΙnn)，为出现任何症状、四肢松软的为氟烷阴性(HaΙNN)或杂合子(HaΙNn)。此方法简单易操作，但检测准确性不高，且只能检出氟烷阳性。生化检测是通过检测猪血液中氟烷基因连锁的酶或血型基因来间接选择基因型，此方法准确性较高，但猪不同品种、品系间连锁群关系有差异，且与氟烷基因位点间有互换，使此方法的应用受到很大限制；目前最为常用的是分子生物学检测方法。已知的猪氟烷基因分子生物学检测方法为普通聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction,PCR)，主要有限制性酶切片段长度多态性分析法(restriction fragment length polymorphism，PCR
‑
RFLP)、一步PCR法和HRM PCR法。PCR
‑
RFLP法使用一对引物进行普通PCR扩增，然后对扩增产物进行限制性酶切，凝胶电泳，根据电泳条带的差异来判断基因型。该方法操作步骤多，过程复杂，耗时较长，酶切的完全与否直接影响对结果的判断，酶切的程度也较难控制，不同产物、不同内切酶的酶切时间都不相同，因此要求实验操作者具有丰富经验。一步PCR法，该法使用两对引物在一个反应体系中进行普通PCR扩增，不同的基因型可以得到不同的PCR扩增产物，然后制作凝胶，电泳PCR产物判断基因型；由一步PCR法衍生的还有荧光定量PCR一步法(SYBR Green法)。相对PCR
‑
RFLP方法，该方法不需要酶切，操作相对简单，但由于使用两对引物扩增产物，容易对PCR扩增效率和结果的判断产生不利影响。另外，以上两种方法都需要制作凝胶，使操作人员接触有毒有害试剂；电泳的电流强度与时间难以控制，容易电泳失败，导致条带无法看清而影响基因型的判定。HRM PCR法使用一对引物，通过荧光定量PCR仪读取高分辨率溶解曲线(High Resolution Melt，HRM)以分辨不同基因型，该方法操作简单，通量大，检测用时短，但是对
荧光定量PCR仪配置要求高，不宜普及应用。
[0004]氟烷基因作为影响肉质的主效基因已经广泛用于猪的标记辅助选择(Marker
‑
assisted selection)，随着氟烷基因标记辅助选择的普及，迫切需要一种高效率，高通量且高准确率的技术来解决如此庞大规模的基因分型。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术旨在克服上述传统方法的技术缺陷，基于探针法荧光定量PCR技术，提供一种猪氟烷基因快速分型试剂盒及其检测方法。该方法通量大，特异性强，重复性好，准确率高且鉴定简便快捷。解决现有技术中的检测猪氟烷基因基因型的方法准确率低、操作步骤多、过程复杂、时间长、检测试剂有毒的技术问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种猪氟烷基因快速分型试剂盒，反应预混液包括引物预混液、探针法荧光定量PCR预混液和ddH2O；
[0008]其中引物预混液：混合液中四条引物浓度均为10μM，引物序列如下：
[0009]上游引物：5
’‑
TTCCCTGTGTGTGTGCAATG
‑3’
，如SEQ ID No.1所示；
[0010]下游引物：5
’‑
ATGAGGTTTGTCTGCAGCAG
‑3’
如SEQ ID No.2所示；
[0011]探针引物1：FAM
‑5’‑
CTTGGTTGGAGCACAC
‑3’‑
mgb如SEQ ID No.3所示；
[0012]探针引物2：VIC
‑5’‑
CTTGGTTGGAGCGCAC
‑3’‑
mgb如SEQ ID No.4所示。
[0013]进一步的，反应总体系为反应预混液+模板DNA；
[0014]反应总体系以体积分数计为20份，具体为：
[0015]探针法荧光定量PCR预混液10份、引物预混液2份、模板DNA2
‑
4份，其余为ddH2O；
[0016]反应总体系的模板DNA终浓度为10
‑
100ng DNA/反应总体系体积。
[0017]进一步的，所述探针法荧光定量PCR预混液的具体组分为：
[0018]HotStar Taq DNA Polymerase(5U/μl)：10
×
PCR Buffer(Mg
2+
Plus)：dNTP Mixture(各2.5mM)的体积比为1:1:2。
[0019]一种猪氟烷基因快速分型检测方法，包括以下步骤：
[0020]步骤1：将引物预混液、探针法荧光定量PCR预混液、RNase
‑
Free ddH2O以及提前抽提好的模板DNA从
‑
20℃冰箱中取出并在冰上融化；
[0021]步骤2：根据权利要求2配置反应预混液，反应预混液体积根据待检样本的数量而定，在理论体积基础上多配置10％；
[0022]步骤3：将反应预混液混合均匀，并分装到PCR管中；
[0023]步骤4：向分装好反应预混液的PCR中添加模板DNA，并轻轻混匀，使一份模板DNA对应的反应总体系为20μl；
[0024]步骤5：根据优化程序，调置好荧光定量仪的工作程序；
[0025]步骤6：将配制好的P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪氟烷基因快速分型试剂盒，其特征在于，反应预混液包括引物预混液、探针法荧光定量PCR预混液和ddH2O；其中引物预混液：混合液中四条引物浓度均为10μM，引物序列如下：上游引物：5
’‑
TTCCCTGTGTGTGTGCAATG
‑3’
，如SEQ ID No.1所示；下游引物：5
’‑
ATGAGGTTTGTCTGCAGCAG
‑3’
如SEQ ID No.2所示；探针引物1：FAM
‑5’‑
CTTGGTTGGAGCACAC
‑3’‑
mgb如SEQ ID No.3所示；探针引物2：VIC
‑5’‑
CTTGGTTGGAGCGCAC
‑3’‑
mgb如SEQ ID No.4所示。2.根据权利要求1所述的一种猪氟烷基因快速分型试剂盒，其特征在于，反应总体系为反应预混液+模板DNA；反应总体系以体积分数计为20份，具体为：探针法荧光定量PCR预混液10份、引物预混液2份、模板DNA2
‑
4份，其余为ddH2O；反应总体系的模板DNA终浓度为10
‑
100ngDNA/反应总体系体积。3.根据权利要求1所述的一种猪氟烷基...

【专利技术属性】
技术研发人员：田明，何鑫淼，刘娣，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院畜牧研究所，
类型：发明
国别省市：