一株氯代有机物降解微杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种氯代有机物降解微杆菌及其应用，涉及微生物技术领域，微杆菌为微杆菌J1

【技术实现步骤摘要】
一株氯代有机物降解微杆菌及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，尤其涉及一株氯代有机物降解微杆菌及其应用。

技术介绍

[0002]氯代有机物是一系列含有氯原子的有机化合物，包括氯代脂肪烃、氯代芳香烃等典型污染物。由于人类医疗、食品、化工、农业等多方面的需求，如氯化烃在农业和工业应用被广泛使用。许多氯代有机物通过化学合成的方式进行大量生产，如氯丙醇、氯丙烷、氯丙烯等。
[0003]大量氯代有机物作为工业副产品排放到环境中造成污染。氯代有机物具有疏水性，释放到陆地环境中的有机卤化物会被土壤颗粒所吸附，在海洋湖泊等水生环境中会作为油水混合物在底部滞留。氯代有机物可以通过食物链进入人体中并在脂肪组织不断积累，具有致癌、致突变的影响且会引起多种并发症。有机氯化物具有“三致”等毒理作用，比如氯丙醇类物质引起生物体多个器官发生病变，如诱发肾脏细胞病变，引起肾小管癌、肾小管腺癌；大鼠生理实验表明氯丙醇类物质会有诱导睾丸病变并引起雄性鼠不孕症和睾丸间质细胞肿瘤，氯丙醇的毒性主要体现在肾脏毒性、生殖毒性、神经毒性、免疫毒性、致突变性和致癌性。
[0004]氯代有机物在环境中受到温度、酸碱等物理化学因素影响可能会发生一定程度上的降解或转化作用。针对氯代有机物的物理化学处理，如对氯代有机物进行高温焚烧，氯代有机物的不完全燃烧容易释放出毒性更强的衍生物。相比物理化学处理法，微生物降解具有成本低，适用环境广泛的特点，微生物降解氯代有机物机制包括厌氧脱卤、氧解脱卤、水解脱卤。水解脱卤中主要以水分子作为辅因子通过亲核加成反应对卤素进行去除，具有卤酸脱卤酶、卤烷脱卤酶、卤乙酯脱卤酶、4
‑
氯苯甲酰辅酶A脱卤酶等多种酶系降解不同的氯代有机物。
[0005]因此，本领域的技术人员致力于开发一种氯代有机物脱卤微杆菌，使其能对氯丙醇、二氯丙醇和环氧氯丙烷等多种氯代有机物具有一定的脱卤能力，鉴定分析微杆菌的水解脱卤酶，能够实现清洁、无二次环境污染的水体修复效果。

技术实现思路

[0006]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何提供一种氯代有机物脱卤微杆菌，使其能对氯丙醇、二氯丙醇和环氧氯丙烷等多种氯代有机物具有一定的脱卤能力，及如何应用该氯代有机物脱卤微杆菌来实现清洁、无二次环境污染的水体修复效果。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种氯代有机物降解微杆菌，微杆菌为微杆菌J1
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1(Microbacterium oxydans J1
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1)，于2021年08月23日在中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学)进行保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 20211062。
[0008]本专利技术还提供了一类与氯代有机物相关的水解脱卤酶，脱卤酶包括：1个卤代烷脱
卤酶(Haloalkane dehalogenase)，1个卤乙酯脱卤酶(Haloacetate dehalogenase)，2个卤酸脱卤酶(Haloacid dehalogenase)，1个4
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氯苯甲酰辅酶A脱卤酶(4
‑
chlorobenzoyl coenzyme A dehalogenase)和1个卤代醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase)。
[0009]进一步地，卤代烷脱卤酶(Haloalkane dehalogenase)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，卤乙酯脱卤酶(Haloacetate dehalogenase)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，卤酸脱卤酶(Haloacid dehalogenase)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，4
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氯苯甲酰辅酶A脱卤酶(4
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chlorobenzoyl coenzyme A dehalogenase)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，卤代醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0010]本专利技术还提供了一种氯代有机物降解微杆菌在氯代有机物脱卤的应用。
[0011]进一步地，应用方法包括以下步骤：
[0012]步骤1、微杆菌J1
‑
1(Microbacterium oxydans J1
‑
1)经过活化转接至LB培养基培养，进行离心收集，重悬，重复收集菌体和清洗菌体，饥饿菌体，得到菌液；
[0013]步骤2、将步骤1得到的菌液分别添加氯代有机物进行休止细胞反应；分别在不同时间进行取样，对样品离心后取上清液检测氯离子浓度，绘制脱卤曲线。
[0014]进一步地，步骤1还包括在LB培养基中在温度30℃，转速200rpm的摇床进行过夜培养，在4℃下进行离心收集，使用Na2SO4溶液进行重悬，重复收集菌体和清洗菌体3次，之后使用Na2SO4溶液调整菌液OD
600
＝5.0，饥饿菌体3小时。
[0015]进一步地，步骤2中氯代有机物包括氯丙醇、二氯丙醇或环氧氯丙烷；添加氯代有机物至终浓度为1,000μL/L。
[0016]进一步地，进行取样的不同时间为0h、3h、6h、18h、24h，对样品离心后取10mL上清液检测氯离子浓度，绘制脱卤曲线。
[0017]本专利技术还提供了一类与氯代有机物相关的脱卤酶在氯代有机物脱卤的应用。
[0018]进一步地，应用方法包括以下步骤：
[0019]步骤1、将微杆菌Microbacterium oxydans J1
‑
1的水解脱卤酶基因通过PCR扩增，构建至质粒载体(如pET
‑
28a质粒等)，通过化学转化法导入表达微生物宿主(如大肠杆菌等)进行水解脱卤酶的异源表达；
[0020]步骤2、使用生物信息分析工具(如Alphafold等)和蛋白质优化(如密码子优化等)辅助解析脱卤酶的蛋白质结构与增强氯代有机物脱卤能力的稳定性。
[0021]本专利技术还提供了一种氯代有机物降解微杆菌在自然或工业环境的复合污染场景中去除氯代有机物的应用，微杆菌的最适生长条件包括盐度1％，温度23℃，pH＝7；可耐受生长条件包括盐度(1％
‑
8％)，温度(23℃
‑
37℃)，pH(7
‑
11)。
[0022]进一步地，微杆菌J1
‑
1(Microbacterium oxydans J1
‑
1)来源自山东滨州化工集团含有氯代有机物的皂化废水，在加入50μL二氯丙醇的100mL无机盐培养基(以下简称MSM培养基)中进行培养、复筛和驯化，能以二氯丙醇作为碳源生长。
[0023]进一步地，微杆菌J1
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1(Microbacterium oxydans J1
‑
1)转接至Luria
‑
Bertani培养基(以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氯代有机物降解微杆菌，其特征在于，所述微杆菌为微杆菌J1
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1(Microbacterium oxydans J1
‑
1)，于2021年08月23日在中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学)进行保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 20211062。2.一类与氯代有机物相关的水解脱卤酶，其特征在于，所述脱卤酶包括：1个卤代烷脱卤酶(Haloalkane dehalogenase)，1个卤乙酯脱卤酶(Haloacetate dehalogenase)，2个卤酸脱卤酶(Haloacid dehalogenase)，1个4
‑
氯苯甲酰辅酶A脱卤酶(4
‑
chlorobenzoyl coenzyme A dehalogenase)和1个卤代醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase)。3.如权利要求2所述的氯代有机物相关的水解脱卤酶，其特征在于，所述卤代烷脱卤酶(Haloalkane dehalogenase)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述卤乙酯脱卤酶(Haloacetate dehalogenase)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述卤酸脱卤酶(Haloacid dehalogenase)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述4
‑
氯苯甲酰辅酶A脱卤酶(4
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chlorobenzoyl coenzyme A dehalogenase)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述卤代醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。4.如权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐鸿志，黄逸群，许平，王伟伟，胡海洋，陶飞，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：