本公开涉及NAD激酶突变体及其制备方法和用途，属于生物技术及分子生物学领域。本公开具体涉及NAD激酶突变体、重组多肽、编码多肽或重组多肽的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞、细胞培养物，以及生产NADP的方法。本公开提供的NAD激酶突变体可以ploy(P)作为膦酰基供体，具备高效催化NAD合成NADP的能力，解决了目前存在的NAD激酶底物耐受能力差、催化效率低的问题，降低了NADP的生物催化合成成本，具有重要的工业应用价值。具有重要的工业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
NAD激酶突变体及其制备方法和用途
[0001]本专利技术属于生物技术及分子生物学领域，涉及NAD激酶突变体及其制备方法和用途，具体涉及NAD激酶突变体、重组多肽、编码多肽或重组多肽的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞、细胞培养物，以及生产NADP的方法。
技术介绍
[0002]烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称：氧化型辅酶Ⅱ，英文名：Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)，是一种极为重要的核苷酸类辅酶。NADP在氧化还原反应中传递质子、电子及能量，并且参与到很多细胞代谢反应中，是生物体内不可缺少的重要辅酶。NADP在生命科学、酶催化不对称合成、医疗保健领域具有广泛的应用。
[0003]NADP在生物中广泛存在，但含量极低。目前合成NADP的方法主要分为化学法和生物法。其中，化学法以烟酰胺为原料，经多步反应合成出NADP，但化学法存在反应路线长、反应条件苛刻、选择性差、副产物多、收率低、污染环境、生产成本高等问题。
[0004]生物法又分为传统的发酵法和酶法，其中发酵法是采用发酵或其它微生物培养技术，通过对酵母或其它微生物的分离、提取，得到NADP，但是该路线的NADP产率低、原料及能源消耗大，生产成本高，限制了NADP的生产。而酶催化合成NADP是一种更为高效的反应，具有反应条件温和、立体选择性强、相比于发酵法转化率高等优点。
[0005]NADP在生物体内的合成，主要在NAD激酶的作用下，利用ATP或多聚磷酸(poly(P))衍生物作为磷酸供体，催化NAD磷酸化而获得。NAD激酶分为两类，一类是以ATP作为磷酰基供体的酶催化NAD磷酸化的ATP
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NAD激酶，另一类是以ploy(P)和ATP作为磷酰基供体的酶催化NAD磷酸化的poly(P)/ATP
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NAD激酶。
[0006]目前已有许多的研究利用NAD激酶合成NADP，但是天然来源的NAD激酶催化能力较弱。为了提升NAD激酶的催化性能，研究者尝试对NAD激酶进行改造，以期提升其性能，例如，引用文献1中公开了对来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的NAD激酶进行改造，使酶活提升1
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1.5倍，但需以昂贵的ATP为磷酰基供体，NADP产量最高为14.5g/L；引用文献2中公开了对来源于闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)的NAD激酶进行改造，NADP转化率能够从80％提高至99％，提高了催化效能，降低了底物残留，但需以昂贵的ATP为磷酰基供体，反应时间长达18h，NAD底物浓度仅40g/L，底物浓度耐受较低；引用文献3中公开了对来源于Myxococcus xanthus的NAD激酶进行改造，提高了催化活性，以聚磷酸钠为磷酰基供体实现了底物最高42g/L的NAD底物催化，但底物浓度耐受仍较低。在引用文献4中首次报道了来自Micrococcus flavus的poly(P)/ATP
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NAD激酶为NAD激酶，相比于以昂贵的ATP为磷酰化供体的NAD激酶，该酶可同时以ATP和ploy(P)为膦酰基供体，但是NAD激酶底物耐受能力仍然比较差，生产效率低。
[0007]因此，现有报道的NAD激酶在制备NADP的转化中普遍存在需以昂贵的ATP作为磷酰基供体，底物浓度耐受低，反应时间较长等问题，即使可以ploy(P)为膦酰基供体，但仍存在底物耐受能力差、生产效率低的问题。为了提升以poly(P)为磷酰化供体的NAD激酶的催化
效率，缩短反应时间，提升NAD激酶底物浓度耐受能力，提高合成液NADP浓度，降低NADP的生物催化合成成本，提高NAD激酶的工业应用价值。本专利技术对氨基酸进行改造，以期获得高底物浓度耐受、高催化活性的NAD激酶突变体。
[0008]引用文献：
[0009]引用文献1：CN103409442B；
[0010]引用文献2：CN114277013A；
[0011]引用文献3：CN115109764A；
[0012]引用文献4：Kawai S,Mori S,Mukai T,Suzuki S,Yamada T,Hashimoto W,Murata K.Inorganic Polyphosphate_ATP
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NAD Kinase of Micrococcus flavus and Mycobacterium tuberculosis H37Rv.Biochem Biophys Res Commun.2000Sep 16；276(1):57
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63。
技术实现思路
[0013]专利技术要解决的问题
[0014]鉴于现有技术中存在的问题，例如，NAD激酶底物耐受能力差、催化效率低。为此，本公开在野生型NAD激酶的基础上，通过人工引入突变，改善其底物耐受能力、提升催化性能。
[0015]本公开提供的NAD激酶突变体，该NAD激酶突变体可以ploy(P)为膦酰基供体，具备在高底物浓度条件下高效催化底物制备NADP的能力，缩短了反应时间、提升了生产效率，降低NADP的生物催化合成成本，具有重要的工业应用价值。
[0016]用于解决问题的方案
[0017]本公开提供了如下技术方案：
[0018][1].NAD激酶突变体，其中，所述NAD激酶突变体包含如下(i)～(iv)组成的组中的任一项：
[0019](i)所述NAD激酶突变体与SEQ ID NO:1所示的序列相比，在对应于SEQ ID NO:1所示所示序列的至少第18、210、219或288位中的一个或多个位置处包含突变；
[0020](ii)与(i)所示序列具有至少98％的序列同一性，且不包括SEQ ID NO:1所示序列的突变体；
[0021](iii)由多核苷酸编码的突变体，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：
[0022](a)编码如(i)所示氨基酸序列的突变体的多核苷酸；
[0023](b)与(a)的全长互补的多核苷酸；
[0024](iv)由(i)、(ii)或(iii)任一项所示的突变体的片段，并且所述片段仍然具有NAD激酶活性。
[0025][2].根据[1]所述的NAD激酶突变体，其中，所述NAD激酶突变体为包含如下(c)～(f)中至少一项所示的突变的突变体：
[0026](c)对应SEQ ID NO:1所示序列的第18位的氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为谷氨酸(E)；
[0027](d)对应SEQ ID NO:1所示序列的第210位的氨基酸由甘氨酸(G)突变为谷氨酸
(E)；
[0028](e)对应SEQ ID NO:1所示序列的第219位的氨基酸由异亮氨酸(I)突变为天冬酰胺(N)；
[0029](f)对应SEQ ID NO:1所示序列的第288位的氨基酸由天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.NAD激酶突变体，其中，所述NAD激酶突变体包含如下(i)～(iv)组成的组中的任一项：(i)所述NAD激酶突变体与SEQ ID NO:1所示的序列相比，在对应于SEQ ID NO:1所示所示序列的至少第18、210、219或288位中的一个或多个位置处包含突变；(ii)与(i)所示序列具有至少98％的序列同一性，且不包括SEQ ID NO:1所示序列的突变体；(iii)由多核苷酸编码的突变体，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：(a)编码如(i)所示氨基酸序列的突变体的多核苷酸；(b)与(a)的全长互补的多核苷酸；(iv)由(i)、(ii)或(iii)任一项所示的突变体的片段，并且所述片段仍然具有NAD激酶活性。2.根据权利要求1所述的NAD激酶突变体，其中，所述NAD激酶突变体为包含如下(c)～(f)中至少一项所示的突变的突变体：(c)对应SEQ ID NO:1所示序列的第18位的氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为谷氨酸(E)；(d)对应SEQ ID NO:1所示序列的第210位的氨基酸由甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)；(e)对应SEQ ID NO:1所示序列的第219位的氨基酸由异亮氨酸(I)突变为天冬酰胺(N)；(f)对应SEQ ID NO:1所示序列的第288位的氨基酸由天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)。3.根据权利要求1或2所述的NAD激酶突变体，其中，所述NAD激酶突变体包括在(i)所示序列的突变体的N端或C端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。4.一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括权利要求1～3任一项所述的NAD激酶突变体，以及与所述NAD激酶突变体融合的外源多肽。5.一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含编码权利要求1～4任一项所述的NAD激酶突变体的核苷酸序列，或包含编码权利要求4所述重组多肽的核苷酸序列。6.一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含权利要求5所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列为包含启动子和/或核糖体结合位点的核苷酸序列，并且所述调控序列指导所述NAD激酶突变体的基因在宿主细胞中表达并合成突变体酶。7.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含权利要求5所述的分离的多核苷酸，或权利要求6所述的核酸构建体。8.一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含权利要求1～3任一项所述的NAD激酶突变...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈永贵，李家龙，杨述章，任杰，范谦，
申请(专利权)人：湖南利尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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