柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种鸡柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法。针对目前对柔嫩艾美耳球虫耐药性的鉴定只有体内方法，耗时长，成本高，效率低下等问题，本发明专利技术提供了一种鸡柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法，通过分离鉴定养殖场的柔嫩艾美耳球虫，制备柔嫩艾美耳球虫子孢子，采用MDBK细胞复苏、传代和毒性检测，确定药物最小抗球虫浓度，在最小抗球虫浓度的药物下进行繁殖抑制实验，计算相对繁殖抑制率并评价耐药性等步骤。本发明专利技术的体外鉴定鸡柔嫩艾美耳球虫耐药性的方法尚属首创，该方法不仅建立了球虫子孢子的制备方法，还确定了体外耐药性的评价标准，该方法简单高效，安全可靠，具有很好的实际应用价值。具有很好的实际应用价值。具有很好的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种鸡柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法。

技术介绍

[0002]鸡球虫病是由顶复门原虫艾美耳属球虫(Eimeria)寄生于鸡肠道黏膜上皮细胞内所引起的一种寄生性原虫病，对全球的养鸡业造成巨大的经济损失。至今，我国公认的鸡艾美耳球虫有7种，其中以柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)致病性最强，危害最为严重。在养鸡生产中，由于球虫疫苗使用效果的稳定性差、存在弱毒返祖等原因，目前药物防控仍然是控制鸡球虫病的主要措施，但是现有的药物由于耐药虫株的产生，面临治疗效果下降甚至失效的风险，使得鸡球虫病成为制约养鸡业健康发展的关键因素之一。
[0003]自90年代起，鸡球虫产生的抗药性问题引起了国内学者的广泛关注，已有大量学者针对不同种类球虫对不同药物的耐药性进行了研究，但目前的耐药性研究都需要建立感染球虫的动物模型，实验周期长，成本高，在养殖场遭遇感染时，无法快速高效的筛选到不耐药的药物，影响预防和治疗效果。目前，还未见有通过体外实验对鸡球虫耐药性进行鉴定的方法，亟本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：a、柔嫩艾美耳球虫的鉴定及分离在养殖场取混合虫株，进行虫种鉴定，确认混合虫株中存在柔嫩艾美耳球虫；通过单卵囊分离技术，分离得到柔嫩艾美耳球虫；b、制备柔嫩艾美耳球虫子孢子将步骤a得到的柔嫩艾美耳球虫离心，弃上清，加入PBS重悬后反复离心至上清液澄清，采用次氯酸钠重悬沉淀，孵育8
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12min，再次离心；再采用PBS重悬去除次氯酸钠；将沉淀中加入PBS，进行涡旋，每次涡旋10
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20s，重复涡旋3
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5次，待孢子囊
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卵囊比率大于90％时，停止涡旋；将涡旋后的上清液采用PBS洗涤2
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3次，将孢子囊离心，弃上清，将沉淀的孢子囊与胰蛋白酶和鸡胆汁在PBS中混合，在40
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41℃下孵育60
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120min，每30min监测一次脱囊率，孵育完成后，将游离的子孢子转移到40
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41℃的葡萄糖中，用安装在无菌连接环上的5
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μm 过滤器通过真空过滤纯化子孢子；然后再离心，洗涤，得到游离子孢子，培养于含有5
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10％新生牛血清的DMEM细胞培养基中；c、MDBK细胞复苏、传代取出MDBK冻存管，水浴解冻，离心，弃上清，沉淀转入DMEM培养基中培养，待细胞生长至80
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90％时，进行细胞传代；采用PBS缓冲液清洗细胞瓶2
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3次，采用胰蛋白酶消化细胞2
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5分钟，当80％以上细胞被消化时，反复吹打细胞，将细胞转移至离心管中离心，弃上清，将细胞在DMEM培养基培养；d、MDBK细胞毒性检测使用MTT试剂盒进行细胞毒性检测，确定药物的CC50值；e、筛选确定药物的最小抗球虫浓度；将步骤a得到的游离子孢子与抗球虫药物同时接种于步骤c得到的MDBK细胞中进行培养，用PBS缓冲液洗涤，将样品分为两部分，一部分加入胰酶消化后收集并转移至离心管中；另一部分加入含有5
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10％新生牛血清的DMEM培养基，孵育至90
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96h，孵育完成后使用胰酶消化收集并转移至离心管中；采用qPCR实验筛选各抗球虫药物的最小抗球虫浓度；f、采用最小抗球虫浓度的药物进行繁殖抑制率实验，根据相对繁殖抑制率评价药物的耐药性。2.根据权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法，其特征在于：满足下述至少一项，步骤b中PBS重悬后离心的条件为室温下1200
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1400xg离心8
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12min；或步骤b中加入氯酸钠重悬后离心的条件为：室温下2000
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2500xg离心3
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【专利技术属性】
技术研发人员：张润慧，杨雪俪，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：