基于PEI功能化GO和ROP双信号放大策略的高灵敏cTnI检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了基于PEI功能化GO和ROP双信号放大策略的高灵敏cTnI检测试剂盒及应用，该试剂盒包括：金电极、Apt1、MCH、Apt2

【技术实现步骤摘要】
基于PEI功能化GO和ROP双信号放大策略的高灵敏cTnI检测试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及基于聚乙烯亚胺(PEI)功能化氧化石墨烯(GO)和开环聚合(ROP)双信号放大策略的高灵敏cTnI检测试剂盒及应用，属于生物分析


技术介绍

[0002]急性心肌梗死(AMI)是造成心血管疾病患者死亡的主要原因，早期诊断对治疗AMI的不可逆损伤至关重要。传统的心电图(ECG)不能满足AMI的特异性检测。心肌肌钙蛋白I(cTnI)因其高度的特异性和敏感性被认为是诊断AMI的金标准。一般情况下，正常健康人的cTnI值通常在0.3ng/mL以下，cTnI值为1.0ng/mL可作为AMI的阳性诊断阈值。因此，开发出灵敏度高、特异性强的cTnI电化学传感器对于AMI的早期诊断、疾病评估和预后具有重要的意义。
[0003]目前，检测cTnI的方法主要有酶联免疫吸附测定法、化学发光免疫分析、荧光免疫分析表面等离子体共振法、比色法、电化学传感法等。其中电化学传感法因其灵敏度高、响应速度快、成本低廉，携带方便、易于微型化和自动化等优点，在AMI的早期诊断和预后方面发挥着越来越重要的作用。特别是基于适配体的电化学传感器，由于其对抗体具有特异性高、免疫原性低、体积小、化学稳定性好、电化学单元易于修饰等优点，越来越受到研究人员的青睐。
[0004]为了提高电化学传感器的分析灵敏度，目前研究者已经开发出许多放大输出信号的策略，如酶催化、纳米材料和聚合物链。聚合反应通过控制聚合物链的动态生长实现信号放大，可有效提高检测灵敏度。其中，开环聚合(ROP)是一种高效的活性聚合反应，具有原子经济性和化学特异性的优点，所制备的聚合物具有良好的生物相容性和生物降解性。二茂铁(Fc)及其衍生物因具有良好的化学稳定性、氧化还原性和低毒性常被用作电化学传感器的电活性探针。较为常见的是二茂铁环氧乙烷类的开环聚合，然此ROP反应常需在高温无氧条件下进行。但以α
‑
氨基酸
‑
N
‑
羧基酸酐(NCA)为单体的ROP是一种简单有效的制备多肽聚合物的方法，它可在室温下发生反应，能使电活性聚合物链接枝在生物分子上而不影响蛋白质的结构，有利于电化学生物传感在临床检测方面的广泛应用。因此，可将Fc与NCA二者结合作为ROP反应的单体。
[0005]氧化石墨烯(GO)作为一种优良的新型碳纳米材料，具有比表面积大、分散性好、表面反应活性强等优异性能。GO表面含有大量含氧活性基团，便于通过共价键和配位键与其他材料或分子结合组装进行功能修饰。聚乙烯亚胺(PEI)是一种含有许多氨基的水溶性聚合物，可通过共价键与环氧基团发生开环反应，因此可制备PEI功能化的GO(PEI
‑
GO)作为ROP反应的大分子引发剂。
[0006]综上，本专利技术目的是研发出以NCA
‑
Fc作为单体，Apt2
‑
GO
‑
PEI为引发剂，基于PEI
‑
GO纳米材料和ROP聚合反应双重信号放大策略的电化学试剂盒，使其具有灵敏度高、选择性好等特点，可用于cTnI的灵敏检测。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种基于聚乙烯亚胺功能化氧化石墨烯和开环聚合双信号放大的高灵敏cTnI检测试剂盒及其使用方法，该试剂盒具有选择性好、灵敏度高等特点。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案之一是：
[0009]基于PEI功能化GO和ROP双信号放大策略的高灵敏cTnI检测试剂盒，包括：金电极、Apt1、MCH、Apt2
‑
GO
‑
PEI生物偶联物、NCA
‑
Fc、LiClO4、超纯水、PBS缓冲液。
[0010]进一步，Apt1的序列为：
[0011]5’‑
SH
‑
(CH2)6‑
CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA
‑3’
。
[0012]进一步，NCA
‑
Fc的合成方法为：
[0013](1)称取二茂铁甲酸溶于DCM中，0℃条件下滴加三乙胺，再依次加入HBTU和HOBT，反应1h后，旋转蒸干，得到产物Fc
‑
OBT；
[0014](2)将TFA在0℃条件下滴入Boc
‑
L
‑
Lys NCA的DCM溶液中，反应1h后，移入室温搅拌过夜，得到NCA产物；
[0015](3)将三乙胺在0℃条件下滴入所制备的Fc
‑
OBT中，然后加入所制备的NCA，室温反应2天，薄层色谱法监测反应过程，反应结束后进行后处理得到单体NCA
‑
Fc。
[0016]其中，
[0017]步骤(1)和(2)中二茂铁甲酸：三乙胺：HBTU：HOBT：Boc
‑
L
‑
Lys NCA的摩尔比例为1：2：1：1：1；
[0018]步骤(2)中TFA：Boc
‑
L
‑
Lys NCA：DCM的比例关系为0.41mL：1mmol：3mL；
[0019]步骤(1)和(3)中三乙胺的用量相同；
[0020]步骤(3)中后处理为依次用饱和NaHCO3溶液、0.5M盐酸溶液、饱和NaHCO3溶液和超纯水洗涤，分离DCM有机相，用无水Na2SO4干燥、过滤，真空干燥。
[0021]进一步，Apt2
‑
GO
‑
PEI生物偶联物的制备方法为：
[0022]将4mg GO
‑
PEI分散在2mLPBS缓冲液中，然后将200μL 10μM Apt2溶液加入上述分散液中，在37℃下孵育3h，将产物离心并洗涤，最后用PBS缓冲液重新分散离心产物，以获得均匀的Apt2
‑
GO
‑
PEI生物偶联物；
[0023]Apt2的序列为：5
’‑
CGCATGCCAAACGTTGCCTCATAGTTCCCTCCCCGTGTCC
‑3’
。
[0024]本专利技术的技术方案之一是：一种所述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0025](1)电极修饰
[0026]①
将Apt1溶液滴加到金电极上，反应，洗涤，吹干；
[0027]②
将步骤
①
的电极浸泡在MCH溶液中，反应，洗涤，吹干；
[0028]③
将待检测样品滴加至步骤
②
的电极表面，反应，洗涤，吹干；
[0029]④
将Apt2
‑
GO
‑
PEI生物偶联物溶液滴加到步骤
③
的电极上，反应，洗涤，吹干；
[0030]⑤...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于PEI功能化GO和ROP双信号放大策略的高灵敏cTnI检测试剂盒，其特征在于，包括：金电极、Apt1、MCH、Apt2
‑
GO
‑
PEI生物偶联物、NCA
‑
Fc。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括LiClO4、超纯水、PBS缓冲液。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，Apt1的序列为：5
’‑
SH
‑
(CH2)6‑
CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA
‑3’
。4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，NCA
‑
Fc的合成方法为：(1)称取二茂铁甲酸溶于DCM中，0℃条件下滴加三乙胺，再依次加入HBTU和HOBT，反应1h后，旋转蒸干，得到产物Fc
‑
OBT；(2)将TFA在0℃条件下滴入Boc
‑
L
‑
Lys NCA的DCM溶液中，反应1h后，移入室温搅拌过夜，得到NCA产物；(3)将三乙胺在0℃条件下滴入所制备的Fc
‑
OBT中，然后加入所制备的NCA，室温反应2天，薄层色谱法监测反应过程，反应结束后进行后处理得到单体NCA
‑
Fc。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，步骤(1)和(2)中二茂铁甲酸：三乙胺：HBTU：HOBT：Boc
‑
L
‑
Lys NCA的摩尔比例为1：2：1：1：1；步骤(2)中TFA：Boc
‑
L
‑
Lys NCA：DCM的比例关系为0.41mL：1mmol：3mL；步骤(1)和(3)中三乙胺的用量相同；步骤(3)中后处理为依次用饱和NaHCO3溶液、0.5M盐酸溶液、饱和NaHCO3溶液和超纯水洗涤，分离DCM有机相，用无水Na2SO4干燥、过滤，真空干燥。6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，Apt2
‑
GO
‑
PEI生物偶联物的制备方法为：将4mg GO
‑
PEI分散在2mLPBS缓冲液中，然后将200μL 10μM Apt2溶液加入上述分散液中，在37℃下孵育3h，将产物离心并洗涤，最后用PBS缓冲液重新分散离心产物，以获得均匀的Apt2
‑
GO
‑
PEI生物偶联物；Apt2的序列为：5
’‑
CGCATGCCAAACGTTGCCTCATAGTTCCCTCCCCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：程迪，张亚萍，周振波，杨怀霞，刘艳菊，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：