一种具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架及其制备方法，所述具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架以平行沟槽拓扑结构的水凝胶定向肌腱干细胞，以施加涂层形成三明治样结构创造三维细胞培养环境；本发明专利技术以具有平行沟槽拓扑结构表面的水凝胶模拟肌腱的胶原纤维排列，避免肌腱细胞收到紊乱结构的影响而导致肌腱结构组成的异常。同时，本发明专利技术以施加水凝胶涂层的方式形成三明治样结构构建三维环境维持肌腱干细胞的分化，减少炎症表型。基于定向肌腱干细胞的三维拓扑生物活性支架为促进肌腱的良好修复，即物理和生物特性的恢复提供了新的模式；本发明专利技术明确了支架的制作方法，并测量了支架的性能，为支架的临床应用提供了基础。临床应用提供了基础。临床应用提供了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架及其制备方法


[0001]本专利技术涉及肌腱损伤修复领域，具体涉及一种具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架及其制备方法。

技术介绍

[0002]肌腱损伤是临床常见的疾病，发病率约占肌肉骨骼损伤疾病的50％。损伤会对患者的生活、经济、职业和健康产生重大影响。在很多情况下，肌腱和韧带的损伤，如常见的扭伤和拉伤，无需手术干预就能痊愈。但自体修复过程通常是十分缓慢的，这些组织可能需要数年时间才能重塑成更有功能的组织。临床上主要通过口服非甾体类消炎药、局部注射封闭等保守治疗。然而，口服药物和激素封闭均无法促进损伤组织再生或延缓病程进展，并有导致感染和疤痕组织的形成的可能康复训练(牵拉训练、深部按摩、肌力训练等)、物理治疗(超声、低能量激光、体外冲击波、冰敷、针灸等)和生物活性制剂注射(如生长因子及干细胞注射)在肌腱损伤中都有应用，有一定治疗效果。但更严重的损伤，如肌腱或韧带完全撕裂，则通常需要手术治疗。这些手术治疗因损伤部位自身修复能力有不同程度的疗效，对于有愈合能力的关节囊外肌腱和韧带，通常将撕裂的肌腱和韧带重新连接。这些手术通常会导致瘢痕组织的形成，而这些修复的组织则更容易再次破裂。而在关节囊内韧带，这种自身愈合能力有限的情况下，经常使用自体组织移植来重建撕裂的韧带。虽然这些重建技术非常成熟，但它们通常会因不同供体部位的组织产生不同的问题，并会在移植肌腱获取过程中发生疼痛和神经损伤等并发症。在没有自体移植组织的情况下，可以使用同种异体移植，但其修复作用通常较差。当使用异体或异体肌腱时，通常进行脱细胞过程以降低其免疫原性作用，但异种肌腱移植并不能完全消除免疫原性。至于同种异体肌腱，其组织供应是有限的。这些问题突出了现今对肌腱组织有效治疗的迫切需要。基于这些事实，理想的重建肌腱断裂的医疗策略可能需要从体外开发具有类似肌腱组织学特性的组织工程。
[0003]肌腱组织受损后，最初形成的愈合基质由随机排列的胶原以及无定形的基质组成，这种愈合基质一般需要一年以上的时间缓慢重建，与此同时，肌腱细胞的功能受到紊乱结构的影响，可能导致肌腱结构和组成的异常，例如异位骨化的产生，组织将永远无法恢复其原有的结构和功能。为了避免形成随机排列的胶原纤维，体外细胞定向排列可能是肌腱功能化组织工程必要的前提步骤。因此，定向仿生支架作为一种生物支架被提出并研究，以进一步模拟组织表面形貌。
[0004]然而，许多细胞类型当从组织中分离出来并置于平面细胞培养中时，会变得越来越平坦，分裂异常并失去它们的分化表型，有趣的是，其中一些细胞类型可以在三维培养环境中恢复其生理形态和功能。

技术实现思路

[0005]针对上述不足，本专利技术提供一种新的肌腱组织工程支架，即一种具有三明治结构
可定向肌腱干细胞并提供三维培养环境的复合支架，本专利技术对内表面具有平行沟槽纹路的GelMA水凝胶薄片对TSPCs细胞行为的影响以及复合三明治结构形成的3D微环境对定向TSPCs细胞表型及功能的影响进行研究，明确具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架对肌腱损伤修复的作用。
[0006]本专利技术是通过一下技术方案实现的：一种具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架在肌腱损伤修复的应用，内芯为内表面具有平行沟槽纹路的圆柱状卷曲的GelMA水凝胶薄片，外壳为圆柱形网状PCL支架，内芯的内表面涂布水凝胶涂层形成三维环境，细胞种植于内芯GelMA水凝胶纹路面可定向肌腱干细胞的粘附迁移。
[0007]一种具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架，包括：GelMA水凝胶片，所述的GelMA水凝胶片的一面设置有若干个平行沟槽，所述的平行沟槽内涂布水凝胶涂层并将细胞种植于所述水凝胶涂层中，所述的GelMA水凝胶片的另一面设置有网状PCL支架。
[0008]使用时，将具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架圆柱状卷曲在肌腱上。
[0009]一种具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架的制备方法，包括以下步骤：
[0010]1)GelMA水凝胶片的制备：
[0011]1.1)水凝胶生物墨水溶液制备：将海绵状冻干GelMA水凝胶粉末与光引发剂LAP于混合器中，再加入柠檬黄，再加入PBS缓冲液；在混合器外包裹隔光纸隔绝外部光源，在40～60℃水浴条件下溶解水凝胶冻干粉末5～20分钟；之后经过离心后，将水凝胶溶液置于40～60℃水浴锅内加热3
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15分钟后，得到水凝胶生物墨水溶液；
[0012]1.2)制作无表面纹路水凝胶薄片：在模具中倒入水凝胶生物墨水溶液，用光固化手电波长400～410nm光下曝光45～75s，使水凝胶生物墨水溶液充分完全交联成胶，然后使用乙醇脱模处理成胶的水凝胶片，经后处理得到无表面纹路水凝胶片；
[0013]1.3)三维打印表面纹路GelMA水凝胶薄片：
[0014]采用的DLP打印制造系统包括一个数字微镜装置，光源为400～410nm波长及XYZ平台；先将水凝胶生物墨水溶液倒入墨水料槽，打印时沉积平台下降，浸入墨水液面，直至距离料槽底部一个层高的间隙，此时在液面以下的间隙内充满了材料；由用户定义的计算机辅助设计文件，即水凝胶片模型，被切割成层，由芯片编辑成光图案；然后，投影仪将第一张切片出来的模型截面图片投射到沉积平台上，通过光学透镜系统编辑好的光图案投射到生物墨水前，会经过料槽底部和材料层；当投影光路到达沉积平台后，可光固化的材料此时在图案光(波长400～410nm)的照射下，发生迅速的光交联反应，被光照到的区域即可同时发生相变，从液态转变为凝胶态；而后，投影仪停止出光，由于料槽底部的离型膜具有疏水的特性，固化的水凝胶结构将与沉积平台一起上升一个层高的距离，形成新的间隙，为下一层的光固化打印做准备；依次重复该过程，投影仪将模型切片而成的截面图案逐层投射出去，通过这种方式，层层打印制最终打印出完整的三维水凝胶结构，经后处理得到具有平行沟槽的GelMA水凝胶片；
[0015]2)在具有平行沟槽的GelMA水凝胶片远离平行沟槽一侧设置有网状PCL支架，同时具有平行沟槽的GelMA水凝胶片的平行沟槽所在一侧内表面涂布有水凝胶涂层形成三维的细胞分化环境，并细胞种植于所述水凝胶涂层中。
[0016]最优选的，所述的应用，
[0017]内芯为内表面具有平行沟槽纹路的圆柱状卷曲的GelMA水凝胶薄片，按以下方法
制备：
[0018](1)水凝胶生物墨水溶液制备：称取1g白色海绵状冻干水凝胶粉末与0.05g光引发剂LAP于50ml离心管中；
[0019]称取25mg柠檬黄加入上述50ml离心管中；为配置成10％水凝胶浓度(w/w)10ml溶液，再加入相应量的1
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PBS缓冲液；在离心管外包裹锡箔纸隔绝外部光源，在50℃水浴条件下溶解水凝胶冻干粉末10分钟；上述溶液会产生少量泡沫，再经过1000rpm离心1分钟后，将水凝胶溶液置于50℃水浴锅内加热5
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10分钟后，取出后立即转移至超净细胞操本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架，其特征在于，包括：GelMA水凝胶片，所述的GelMA水凝胶片的一面设置有若干个平行沟槽，所述的平行沟槽内涂布水凝胶涂层，所述的GelMA水凝胶片的另一面设置有网状PCL支架。2.根据权利要求1所述的具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架，其特征在于，所述水凝胶涂层中种植有细胞。3.根据权利要求1或2所述的具有三明治结构可定向肌腱干细胞的复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)GelMA水凝胶片的制备：1.1)水凝胶生物墨水溶液制备：将海绵状冻干GelMA水凝胶粉末与光引发剂LAP于混合器中，再加入柠檬黄，再加入PBS缓冲液；在混合器外包裹隔光纸隔绝外部光源，在水浴条件下溶解水凝胶冻干粉末；之后经过离心后，将水凝胶溶液置于水浴锅内加热后，得到水凝胶生物墨水溶液；1.2)制作无表面纹路水凝胶薄片：在模具中倒入水凝胶生物墨水溶液，用光固化手电下曝光，使水凝胶生物墨水溶液充分完全交联成胶，然后使用乙醇脱模处理成胶的水凝胶片，经后处理得到无表面纹路水凝胶片；1.3)三维打印表面纹路GelMA水凝胶薄片：采用的DLP打印制造系统包括一个数字微镜装置，光源为400～410nm波长及XYZ平台；先将水凝胶生物墨水溶液倒入墨水料槽，打印时沉积平台下降，浸入墨水液面，直至距离料槽底部一个层高的间隙，此时在液面以下的间隙内充满了材料；由用户定义的计算机辅助设计文件，即水凝胶片模型，被切割成层，由芯片编辑成光图案；然后，投影仪将第一张切片出来的模型截面图片投射到沉积平台上，通过光学透镜系统编辑好的光图案投射到生物墨水前，会经过料槽底部...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜瑞健，项智辉，冯刚，吴怡梵，李思浩，郑强，施梦佳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：