一种指压式无扩增核酸检测微流控芯片及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种指压式无扩增核酸检测的微流控芯片，包括流道层、薄膜层和指压层，流道层包含检测腔室、样本储液池、反应液储液池、蛇形流道、气阀，其中反应液储液池中包含基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种指压式无扩增核酸检测微流控芯片及其检测方法


[0001]本专利技术涉及微流控技术以及分子诊断领域，具体属于一种指压式无扩增核酸检测微流控芯片及其检测方法。
技术背景
[0002]传统核酸检测的过程，第一步是样本采集以及核酸纯化。样本可以是血液、尿液、唾液等体液，采集后需进行预处理裂解细胞使得细胞破碎，释放出细胞膜、蛋白质、多糖、DNA、RNA等物质。而细胞膜、蛋白质等物质会对后续的扩增有一定的影响，需要通过一些手段如磁珠法、浓盐法等去除杂质纯化核酸。第二步是核酸扩增，该过程中最常用的技术即是聚合酶链反应(PCR)，通过解链、退火、延伸三步增多特定目的片段，放大检测信号。扩增之后使用荧光检测、比色或者浊度检测等方法进行核酸检测。
[0003]以上过程较为复杂，用时较长，并且在核酸检测过程需要专业人员进行复杂的操作。对于一些偏远及基层医院环境设备较为局限的地区，使用传统的核酸检测方式较为困难，检测效率亟待提高。而微流控技术是将化学生物等一些流体实验集中缩小至微米尺度中操作的一种技术。近年来，微流控技术融合多个领域快速发展，并得到广泛的应用。
[0004]基于CRISPR的核酸检测，如SHERLOCK和DETECTR，作为快速和敏感的方法，最近一直吸引着人们的热切关注。这些基于CRISPR的方法包括目标核酸的预扩增过程和随后由CRISPR
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Cas酶介导的检测，如Cas12a或Cas13a通过荧光或比色读出。然而，预扩增过程增加了检测时间(至少几十分钟)，并可能由于扩增错误而造成假阴性或假阳性结果。目前已有用于核酸检测的微流控芯片，中国专利“申请号：202210955530.6”提出了一种集等温扩增和CRISPR
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cas系统一体的用于核酸检测的微流控芯片及检测方法，该种方式需要外源提供离心力，无法实现便携，且需要对样本进行预扩增，步骤较为繁琐。中国专利“申请号：202011131328.9”提出一种指压式的用于核酸检测的微流控芯片，该芯片核酸纯化步骤复杂，且扩增需要外源提供65℃高温，不利用制备成便携的检测设备。为克服这些挑战，本专利技术将CRISPR
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Cas13的核酸检测系统和微流控芯片结合，开发了一种无扩增的检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术基于微流控技术开发了一款指压式无扩增的核酸检测微流控芯片
[0006]本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：
[0007]一种指压式无扩增核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述芯片结构包括流道层、薄膜层和指压层；所述芯片采用层压的技术进行封合；所述芯片是基于CRISPR
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cas13a系统的无扩增荧光检测方法进行核酸检测。
[0008]根据权利要求1所述的指压式无扩增核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述芯片包含检测腔室、样本储液池、反应液储液池、蛇形流道、气阀；其中，反应液储液池中含有基于CRISPR
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cas13a的无扩增反应体系，该无扩增反应体系包含无引物复水缓冲液、转录优化5X缓冲液、rNTP、T7聚合酶、Rnase抑制剂、荧光Reporter、CrRNA以及CRISPR
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Cas13a溶液。
[0009]权利要求2所述的检测腔室，其特征在于，样本液与CRISPR
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cas13a无扩增反应体系在检测腔室中混合，完成检测；所述腔室的温度通过接触外部的恒温控制板来维持37℃的反应条件，通过将芯片置于荧光检测平台中，实时检测荧光强度的变化来反映循环扩增情况。
[0010]权利要求2所述的样本储液池和反应液储液池，其特征在于，样本储液池和反应液储液池中的液体通过指压的方式使气阀开闭，从而控制流体定向流入检测腔室；当按下指压阀门时，气体向两侧流动，推动流体向检测腔室流动，当放开指压阀门时，气体向两侧流动，推动储液池中的流体向检测腔室的方向流动，通过反复操作指压阀门可控制液体定量流动。
[0011]根据权利要求1所述的指压式无扩增核酸检测微流控芯片，其特征在于，其核酸检测方法包括以下步骤：
[0012](a)使用移液枪向样本液储液池中加入20
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30μL裂解后的样本液，向反应液储液池中加入40
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50μL反应液混合液，反应液混合液包括16.13
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26.13μL无引物复水缓冲液、10μL转录优化5X缓冲液、5μL rNTP、1μL T7聚合酶、1μL Rnase抑制剂、1μL荧光Reporter、1μL质粒溶液、0.12μL CrRNA以及0.45μLCRISPR
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Cas13a溶液；
[0013](b)按下指压样本储液池的阀门使得样本液流至检测腔室；
[0014](c)按下指压反应液储液池的阀门使得反应液流至检测腔室；
[0015](d)控制核酸恒温检测单元的温度为37
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42℃，在显微镜下观测反应物的荧光强度，并定量分析核酸浓度。
[0016]根据权利要求1所述的指压式无扩增核酸检测的微流控芯片，其特征在于，所述指压层和流道层的材料不限于采用聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、丙烯腈
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丁二烯
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苯乙烯共聚物(ABS)，指压层和流道层采用注塑成型方式；注塑成型为，预先加工出模具，然后将聚丙烯(PP)材料在220
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280℃的恒温料筒中融化，然后加压140
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800MPa将融化后的PP材料注入模具，之后保压、冷却成型；芯片中核酸提取单元使用机加工的方式，在核酸提取腔室加工一定形状的微阵列，经过表面处理之后可达到吸附核酸的作用；薄膜层的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，可通过等离子处理后与其他材料键合。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0018]本专利技术将实时荧光核酸检测实现在微流控芯片上，简化了繁琐的人为操作；同时，本专利技术基于CRISPR
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cas13a系统实现无扩增检测，简化了预扩增的步骤；该设备实现了检测实验从试管到芯片、从手动到自动、从复杂到简单的转变；本专利技术中使用手指按压驱动的方式实现流体的顺序释放，提供一种便携式无需借助外部设备的驱动方式，该种驱动方式可以摆脱仪器与环境的束缚，可随时随地进行检测；同时，本专利技术中指压驱动方式每次按压驱动量与圆形腔室的大小有关，可实现定量泵送。
附图说明
[0019]图1为指压式的无扩增核酸检测微流控芯片的结构示意图；
[0020]图2为流道层(1)的结构示意图；
[0021]图3为指压层(3)的结构示意图；
[0022]图4为样本液气阀与反应液气阀的工作原理示意图。
具体实施方式
[0023]以下对本专利技术的实施方式做详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种指压式无扩增核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述芯片结构包括流道层、薄膜层和指压层；所述芯片采用层压的技术进行封合；所述芯片是基于CRISPR
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cas13a系统的无扩增荧光检测方法进行核酸检测。2.根据权利要求1所述的指压式无扩增核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述芯片包含检测腔室、样本储液池、反应液储液池、蛇形流道、气阀；其中，反应液储液池中含有基于CRISPR
‑
cas13a的无扩增反应体系，该无扩增反应体系包含无引物复水缓冲液、转录优化5X缓冲液、rNTP、T7聚合酶、Rnase抑制剂、荧光Reporter、CrRNA以及CRISPR
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Cas13a溶液。3.权利要求2所述的检测腔室，其特征在于，样本液与CRISPR
‑
cas13a无扩增反应体系在检测腔室中混合，完成检测；所述腔室的温度通过接触外部的恒温控制板来维持37℃的反应条件，通过将芯片置于荧光检测平台中，实时检测荧光强度的变化来反映循环扩增情况。4.权利要求2所述的样本储液池和反应液储液池，其特征在于，样本储液池和反应液储液池中的液体通过指压的方式使气阀开闭，从而控制流体定向流入检测腔室；当按下指压阀门时，气体向两侧流动，推动流体向检测腔室流动，当放开指压阀门时，气体向两侧流动，推动储液池中的流体向检测腔室的方向流动，通过反复操作指压阀门可控制液体定量流动。5.根据权利要求1所述的指压式无扩增核酸检测微流控芯片，其特征在于，其核酸检测方法包括以下步骤：(a)使用移液枪向样本液储液池中加入20
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30μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢佑强，武文涛，
申请(专利权)人：武文涛，
类型：发明
国别省市：